基于磷脂基紫杉醇納米前藥的抗腫瘤應(yīng)用研究

化療在腫瘤的臨床治療中發(fā)揮著不可或缺的作用[1,2]. 由于腫瘤的異質(zhì)性和微環(huán)境的復(fù)雜性，臨床化療的治療效果并不理想[3,4]. 大多數(shù)化療制劑具有快速的藥代動(dòng)力學(xué)和非特異性的藥物分布，活性藥物在腫瘤的蓄積量很低，且治療過程伴隨著嚴(yán)重的全身毒性[5~7]. 為了解決上述問題，一系列藥物輔料，如聚合物[8,9]、磷脂[10,11]、蛋白質(zhì)[12,13]和基因[14,15]等，被用作載體構(gòu)建納米遞送體系. 藥物的溶解性在很大程度上得到了提高，且納米的尺寸效應(yīng)有利于延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，促進(jìn)藥物在腫瘤組織蓄積[16~18]. 然而這些納米藥物普遍存在載藥量低、藥物釋放不可控的問題[19]. 大量輔料的使用也增加了不必要的代謝負(fù)擔(dān)和免疫毒性的風(fēng)險(xiǎn)[20]. 前藥型納米藥物有望解決上述難題.

前藥是通過化學(xué)修飾原藥分子得到的一類沒有藥物活性的分子[21]. 需在特定的刺激下釋放出原藥分子才能發(fā)揮抗癌療效[22,23]. 腫瘤具有特異性微環(huán)境，如氧化還原物質(zhì)含量高、微酸、乏氧和高表達(dá)多種特異型酶等，這為構(gòu)建腫瘤微環(huán)境響應(yīng)的前藥提供了有利的條件[24~26]. 設(shè)計(jì)合成響應(yīng)型前藥，有利于藥物在腫瘤精準(zhǔn)釋放，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)納米藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷[27,28]. 二聚體前藥是由2個(gè)相同的藥物分子橋連而成，能夠自組裝形成穩(wěn)定的納米顆粒[29]. 二聚體前藥策略能夠顯著提高制劑中的藥物含量，我們課題組報(bào)道了一系列氧化還原[6,30]、酶[31]和乏氧[32]響應(yīng)的紫杉醇二聚體前藥. 考慮到藥物的體內(nèi)高效遞送，加入載體材料提高納米藥物的循環(huán)穩(wěn)定性是必要的.

脂質(zhì)體具有類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，具有較好的生物相容性和較高的藥物遞送效率[33]. 臨床上就有脂質(zhì)體-紫杉醇(Lipusu)[34]，脂質(zhì)體-阿霉素(Doxil)[35]等制劑被成功開發(fā)和應(yīng)用. 磷脂作為脂質(zhì)體的重要組成部分，其雙親的結(jié)構(gòu)使其在藥物組裝和體內(nèi)遞送方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[36,37]. 兩性離子的結(jié)構(gòu)對(duì)抑制蛋白吸附和維持體內(nèi)循環(huán)穩(wěn)定性起著非常關(guān)鍵的作用[38,39]. 然而，親水部分結(jié)構(gòu)和所帶電荷對(duì)藥物遞送的影響并不清楚. 闡明不同結(jié)構(gòu)磷脂對(duì)藥物組裝、穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性、體內(nèi)分布和抗腫瘤效果等方面的影響，有助于開發(fā)性能優(yōu)異的磷脂型納米遞送體系. 基于此，我們以紫杉醇二聚體為模型藥物，以不同結(jié)構(gòu)的磷脂分子為藥物載體，構(gòu)建了磷脂基刺激響應(yīng)藥物遞送體系. 如圖1所示，2種磷脂載體，磷脂酰膽堿DPPC和聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺DSPE-PEG，和紫杉醇二聚體(PTX2-SS)通過納米沉淀的方法組裝制備成納米紫杉醇藥物，得到的PTX2-SS@DPPC NPs和PTX2-SS@DSPE-PEG NPs分別命名為DcP NPs和DeP NPs. 我們深入研究了磷脂輔料對(duì)紫杉醇納米劑型的物理化學(xué)性質(zhì)和遞送效率的影響.

Fig. 1  The schematic illustration of the formation of DeP NPs and their in vivo drug delivery.

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1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料

紫杉醇(PTX)購自大連美倫生物科技有限公司. 4-二甲氨基吡啶(DMAP)購于阿拉丁科技(中國)有限公司. 亞二硫基二乙酸購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司. 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)購自上海源葉生物科技有限公司. 超純水由Milli-Q系統(tǒng)(Millipore，USA)制備. 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚(乙二醇) (DSPE-PEG)購于上海芃碩生物科技有限公司. 1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿(DPPC)購于薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司. 細(xì)胞培養(yǎng)皿、離心管均購于耐思生命科技股份有限公司. 6孔板和96孔板均購買于廣州潔特生物過濾股份有限公司. Calcein/PI細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒和抗體法微管紅色熒光探針(Tubulin-Tracker Red)購于上海碧云天生物科技有限公司.

1.2 PTX2-SS的合成

根據(jù)我們之前的工作合成了2,2'-二硫代二乙酸橋連的PTX二聚體(PTX2-SS)[8].

1.3 DeP NPs的制備

將質(zhì)量比為1:3的PTX2-SS與DSPE-PEG溶于4 mL四氫呋喃(THF)中. 在室溫條件下，將上述THF溶液緩慢地滴入10 mL超純水中. 室溫?cái)嚢?，并用去離子水透析，直至THF完全除去. 以3500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，去除未組裝的PTX2-SS和DSPE-PEG，即可得到DeP NPs. DPPC和PTX2-SS的組裝操作和上述相同，不同地，當(dāng)有機(jī)溶劑揮發(fā)完全后，得不到均勻的納米顆粒.

1.4 膠體穩(wěn)定性測(cè)試

將DeP NPs與含10%胎牛血清(FBS)的PBS、無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和葡萄糖(GLU)溶液在室溫下共同孵育不同時(shí)間，用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)定納米藥物的尺寸變化.

1.5 PTX2-SS與載體的組裝驅(qū)動(dòng)力

在37 ℃下，將DeP NPs與NaCl、尿素(Urea)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)振蕩孵育12 h. 采用DLS測(cè)定粒徑和多分散系數(shù)(PDI)的變化.

1.6 DeP NPs的H2O2響應(yīng)性藥物釋放

將NPs (含30 μg PTX2-SS)置于500 μL的釋放介質(zhì)(PBS (pH=7.4)/乙醇 = 7/3 (V/V)，含10 mmol/L H2O2)中，在37 ℃下孵育不同時(shí)間后，將500 μL乙腈加入上述釋放液. 1×104 r/min高速離心6 min后，取上清，并利用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)NPs的氧化響應(yīng)性藥物釋放，其中，檢測(cè)波長設(shè)置為231 nm.

1.7 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

L929 (小鼠成纖維細(xì)胞) 和HeLa (人宮頸癌細(xì)胞)在含10%FBS (GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)中培養(yǎng)，4T1 (小鼠乳腺癌)細(xì)胞株在含10%FBS (GIBCO)的RPMI-1640培養(yǎng)基(BI)中培養(yǎng). 細(xì)胞在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換一次培養(yǎng)基.

1.8 用CLSM測(cè)定細(xì)胞攝取

用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)測(cè)定細(xì)胞對(duì)BDP@DeP NPs的攝取情況. 首先，將4T1細(xì)胞接種在六孔培養(yǎng)板中(每孔2×105個(gè)細(xì)胞)，在37 ℃下，孵育24 h使細(xì)胞貼壁. 然后，將培養(yǎng)液吸出，加入用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋的BDP@DeP NPs，每孔加入1 mL，其中BDP濃度為0.1 μg·mL-1. 分別在37 oC下孵育0.5和2 h，在4 ℃下孵育2 h后，將NPs吸出，隨后用Hoechst 33258染色細(xì)胞核，染色時(shí)間為5 min，最后用CLSM對(duì)細(xì)胞成像. 溶酶體共定位實(shí)驗(yàn)大致操作相同，區(qū)別是用BDP@DeP NPs孵育細(xì)胞2 h后，需用Lyso-Tracker Green染色溶酶體30 min，用于定位細(xì)胞內(nèi)的溶酶體. HeLa細(xì)胞的攝取測(cè)定操作大致相同，區(qū)別是加入納米藥物后，孵育細(xì)胞的時(shí)間為3 h.

1.9 細(xì)胞活性測(cè)定

通過MTT法檢測(cè)NPs對(duì)不同細(xì)胞的細(xì)胞毒性. 首先，用100 μL RPMI-1640/DMEM培養(yǎng)基以2×103細(xì)胞/孔的密度在96孔板中接種腫瘤/正常細(xì)胞. 孵育24 h后待細(xì)胞貼壁，將培養(yǎng)基吸出，替換為100 μL用RPMI-1640/DMEM培養(yǎng)基稀釋的NPs和Taxol，同時(shí)設(shè)置加入空白培養(yǎng)基的對(duì)照組. 待細(xì)胞孵育48 h后，每孔加入20 μL MTT (5 mg·mL-1)，在37 ℃下孵育額外的4 h. 然后，小心地將培養(yǎng)基吸出，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)用于溶解形成的紫色甲瓚晶體. 最后，將96孔板振蕩3 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)紫色產(chǎn)物在490 nm處的吸光度.

1.10 Calcein-AM/PI染色實(shí)驗(yàn)

用Calcein-AM和PI染色細(xì)胞，能夠區(qū)分死細(xì)胞(紅色熒光)和活細(xì)胞(綠色熒光). 用相同PTX濃度(40 μmol/L)的Taxol和DeP NPs在37 ℃下孵育4T1細(xì)胞60 h后，吸出培養(yǎng)液，加入Calcein-AM/PI染色液，在室溫下避光孵育30 min. 最后，用熒光顯微鏡對(duì)處理后的細(xì)胞進(jìn)行成像.

1.11 微管染色實(shí)驗(yàn)

用相同PTX濃度(30 μmol/L)的Taxol和DeP NPs孵育4T1細(xì)胞24 h后，吸出培養(yǎng)液，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞12 min，然后用含0.1% Triton X-100的PBS (pH=7.4)溶液清洗細(xì)胞2次. 再用含有0.1% Triton X-100和3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS (pH=7.4)溶液稀釋的微管蛋白免疫染色二抗孵育細(xì)胞，室溫避光染色30 min. 最后，用CLSM成像細(xì)胞的微管.

1.12 活體熒光成像和動(dòng)物抑瘤實(shí)驗(yàn)

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No. 2022-0006). 雌性Balb/c小鼠購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，并在規(guī)定條件下飼養(yǎng).

(1) 構(gòu)建皮下小鼠乳腺癌異體移植瘤作為動(dòng)物模型，研究DeP NPs的生物分布. 將4T1細(xì)胞皮下接種于小鼠右前肢外側(cè)，每只接種2×106個(gè)細(xì)胞. 在腫瘤達(dá)到合適大小后，小鼠(n=3)分別經(jīng)尾靜脈給藥IR@DeP NPs，注射后于1、6、12、24、36和48 h采集體內(nèi)近紅外熒光圖像. 然后處死小鼠，對(duì)離體器官和腫瘤成像.

(2) 構(gòu)建皮下小鼠乳腺癌異體移植瘤作為動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)DeP NPs的抗腫瘤療效. 具體地，將4T1細(xì)胞皮下接種于小鼠左前肢外側(cè)，每只接種2×106個(gè)細(xì)胞. 待腫瘤長到50~100 mm3，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為3組(n=5)：(1) PBS (空白對(duì)照)、(2) Taxol、(3) DeP NPs. 治療前，對(duì)小鼠進(jìn)行標(biāo)記、稱重和瘤徑測(cè)量. 分別在第0、2、4、6、9天，給相應(yīng)荷瘤小鼠靜脈注射PBS、Taxol和DeP NPs，注射PTX劑量為15 mg·kg-1 (藥重/體重). 在第0、2、4、6、8、10、12、14、16天測(cè)量小鼠體重和腫瘤體積. 第17天安樂處死小鼠，解剖出腫瘤，用于更直觀地評(píng)價(jià)納米制劑的抑瘤效果. 為了評(píng)價(jià)藥物的安全性，同時(shí)測(cè)定了血常規(guī). 并采集主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)和腫瘤，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，進(jìn)一步用蘇木精和伊紅(H&E)染色，評(píng)估主要臟器潛在毒性和癌細(xì)胞凋亡程度.

2 結(jié)果與討論

2.1 磷脂基前藥納米粒子的制備和表征

首先使用納米沉淀的方法將DPPC和DSPE-PEG分別與PTX2-SS組裝制備納米材料. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTX2-SS和DPPC難以形成穩(wěn)定的納米顆粒，大部分以沉淀的方式析出 (電子支持信息圖S1)；而PTX2-SS與DSPE-PEG可以得到均勻的納米顆粒(命名為DeP NPs). 如圖2(a)和2(b)所示，利用DLS對(duì)納米粒子的水合粒徑和表面電位進(jìn)行了表征. DeP NPs的平均粒徑為201.1 nm，且?guī)ж?fù)電，ζ電位為-13.8 mV，從圖2(c)所示的透射電鏡(TEM)圖中可以看出，DeP NPs形成了具有納米尺寸的規(guī)則膠束形貌. 如圖2(d)所示，在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基、含10% FBS的PBS(pH=7. 4)和5% GLU溶液中檢測(cè)了DeP NPs的膠體穩(wěn)定性. 在24 h內(nèi)，DeP NPs顯示出可忽略的尺寸變化，證實(shí)了其較好的膠體穩(wěn)定性. 為了闡明磷脂載體和PTX2-SS組裝的驅(qū)動(dòng)力，分別用氯化鈉(NaCl)、尿素(urea)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)處理DeP NPs. 如圖2(e)所示，Triton X-100處理使DeP NPs顆粒尺寸明顯減小，PDI增加，證實(shí)了疏水相互作用在組裝過程中起主導(dǎo)作用. 這些結(jié)果表明，DeP NPs具有較好的膠體穩(wěn)定性.

Fig. 2  (a) Size distribution, (b) ζ-potential, and (c) TEM image of DeP NPs. (d) Stability detection of DeP NPs in the presence of PBS solution containing 10% FBS, serum-free RPMI-1640 and 5% glucose solution. (e) The changes of size and PDI of DeP NPs after treatment with deionized water, NaCl, urea and Triton X-100 solutions.

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2.2 DeP NPs的氧化響應(yīng)型藥物釋放

前藥的響應(yīng)性藥物釋放對(duì)其發(fā)揮抗腫瘤作用至關(guān)重要. 因此，我們利用10 mmol/L的過氧化氫(H2O2)模擬腫瘤細(xì)胞內(nèi)氧化微環(huán)境，采用HPLC監(jiān)測(cè)DeP NPs的藥物釋放行為. 如圖3(a)和3(b)所示，在H2O2存在的情況下，DeP NPs中的前藥發(fā)生了降解，同時(shí)生成了PTX，且PTX的釋放展現(xiàn)了時(shí)間依賴性. 根據(jù)我們之前的研究，具體的釋放機(jī)理可能為：PTX前藥先被H2O2氧化成亞硫砜或硫砜，并進(jìn)一步水解生成PTX[8].

Fig. 3  (a) The HPLC analysis of PTX release from DeP NPs treated with 10 mmol/L H2O2. (b) The corresponding PTX release curves of DeP NPs in the presence of 10 mmol/L H2O2.

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2.3 DeP NPs的細(xì)胞攝取

進(jìn)一步利用氟硼二吡咯(BDP)標(biāo)記納米粒子，研究其在胞內(nèi)的分布情況. 將DSPE-PEG和BDP、PTX2-SS共組裝，得到BDP@DeP NPs. 如圖4(a)所示，和游離的BDP相比，BDP@DeP NPs的最大吸收波長紅移了約10 nm，表明BDP以聚集組裝形式存在. 和BDP小分子相比，納米顆粒的熒光淬滅也再次證實(shí)了BDP在納米粒中的聚集狀態(tài)，說明BDP分子已經(jīng)被成功地?fù)?dān)載進(jìn)DeP NPs中(圖4(b)). 在37 ℃下，將4T1細(xì)胞與BDP@DeP NPs孵育不同時(shí)間(0.5和2 h)，并通過CLSM觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光. 如圖4(c)所示，隨著孵育時(shí)間的增加，從0.5~2 h，胞內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，表明BDP@DeP NPs可以被細(xì)胞成功內(nèi)吞，且內(nèi)吞呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的增強(qiáng). 同樣的內(nèi)吞行為在HeLa細(xì)胞中也被驗(yàn)證(電子支持信息圖S2). 此外，從圖4(c)中可以看出，與37 ℃相比，4 ℃的孵育條件下，4T1細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光強(qiáng)度明顯降低，這表明內(nèi)吞作用是能量依賴的. 我們進(jìn)一步使用溶酶體綠色熒光探針標(biāo)記細(xì)胞的溶酶體. 如圖4(d)所示，紅色熒光和綠色的熒光高度重疊，共定位系數(shù)為0.93，表明納米粒子是通過內(nèi)涵體和溶酶體途徑進(jìn)入細(xì)胞.

Fig. 4  (a) The absorption and (b) fluorescence spectra of free BDP and BDP@DeP NPs at the same BDP concentration. (c) CLSM images of 4T1 cells treated with BDP@DeP NPs at different incubation time and temperature. (d) Co-localization with lysosome of BDP@DeP NPs after being internalized by 4T1 cells for 2 h. (e) Corresponding fluorescence coincidence curves of NPs and lysosomes.

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2.4 DeP NPs的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

接著采用噻唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)對(duì)DeP NPs的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)估. 在37 ℃下，將4T1細(xì)胞分別與相同PTX濃度的Taxol和DeP NPs孵育48 h. 如圖5(a)所示，DeP NPs展示了較高的細(xì)胞抑制活力，在30 μmol/L的濃度下即可使4T1細(xì)胞生存力降至50%以下，這表明納米粒在細(xì)胞內(nèi)可成功釋放PTX，進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞. 我們注意到，納米粒組的細(xì)胞毒性不如游離藥物，這可能是因?yàn)榍八幵?8 h的孵育時(shí)間內(nèi)未完全釋放出原藥分子. 考慮到腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞內(nèi)氧化還原劑含量的差異，我們探究了納米粒對(duì)正常細(xì)胞(L929)的毒性. 結(jié)果如圖5(b)所示，Taxol對(duì)L929和4T1的細(xì)胞毒性幾乎一致，而DeP NPs對(duì)L929的細(xì)胞毒性明顯降低，即使在的濃度50 μmol/L下，細(xì)胞抑制率也不到50%，這說明DeP NPs可以部分選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞. 接下來，使用活死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)更直觀地觀察各劑型的細(xì)胞毒性. 如圖5(c)中的熒光顯微鏡圖像所示，與PBS組細(xì)胞相比，DeP NPs處理組細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了明顯的紅色熒光，這也與MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致. PTX可以通過與β-微管蛋白特異性結(jié)合來抑制微管蛋白解聚，從而導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂功能障礙，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡. 本文通過微管的免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)探究PTX前藥制劑的抗腫瘤機(jī)制. 如圖5(d)所示，未加藥組4T1細(xì)胞具有明顯的微管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而用含PTX的納米前藥和Taxol處理的細(xì)胞則會(huì)引起不同程度的微管聚集. 這說明了DeP NPs可以在胞內(nèi)釋放出活性PTX.

Fig. 5  Cytotoxicity of Taxol, DeP NPs against 4T1 (a) and L929 cells (b). (c) Fluorescence microscope images of live and dead 4T1 cells after incubation with Taxol and DeP NPs (PTX concentration: 40 μmol/L). (d) The morphological changes of microtubules of 4T1 cells after incubation with Taxol and DeP NPs (PTX concentration: 30 μmol/L) for 24 h.

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2.5 DeP NPs的體內(nèi)生物分布

采用近紅外染料IR-780標(biāo)記DeP NPs，并構(gòu)建小鼠乳腺癌4T1異體移植瘤動(dòng)物模型，用于研究DeP NPs的體內(nèi)生物分布和腫瘤蓄積情況. 首先將DSPE-PEG，與IR-780和PTX2-SS共組裝，得到同時(shí)擔(dān)載IR780和PTX2-SS的IR@DeP NPs. 如電子支持信息圖S3(a)所示，和游離的IR-780相比，IR@DeP NPs的紫外吸收光譜峰形變寬，表明IR-780以聚集組裝形式存在. 和IR-780小分子相比，納米顆粒的熒光淬滅也再次證實(shí)了IR-780在納米粒中的聚集狀態(tài)，說明IR-780分子已經(jīng)被成功地?fù)?dān)載進(jìn)DeP NPs中(電子支持信息圖S3(b)). 將得到的納米制劑通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，并使用活體成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)藥物在體內(nèi)的分布. 在注射藥物后48 h，將小鼠處死，并收集其主要的器官(心、肝、脾、肺和腎)和腫瘤，進(jìn)行離體熒光成像. 如圖6(a)所示，DeP NPs組的小鼠，在給藥1 h后其腫瘤內(nèi)即呈現(xiàn)明顯增強(qiáng)的熒光信號(hào)，且在48 h內(nèi)該信號(hào)仍保持在相對(duì)較高的水平. 如圖6(c)所示，熒光強(qiáng)度的半定量柱狀圖進(jìn)一步表明了DeP NPs較多的腫瘤蓄積. 從圖6(b)和6(d)可以看出，DeP NPs在肝和脾蓄積較少，而在腫瘤內(nèi)的蓄積較多. 證實(shí)了DSPE-PEG作為載體遞送紫杉醇前藥的優(yōu)勢(shì).

Fig. 6  (a) The in vivo NIR fluorescence images of 4T1 cells-suffering mice after intravenous injection of IR@DeP NPs and (b) the corresponding isolated organs and tumor tissues collected at 48 h post-injection. He, Li, Sp, Lu, Ki, Tu represent heart, liver, spleen, lung, kidney and tumor, respectively. Semi-quantitative analysis of fluorescence intensity of tumor in vivo (c), and isolated main organs and tumor (d) (n=3).

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2.6 DeP NPs的體內(nèi)抑瘤效果和生物安全性

采用4T1異體移植腫瘤模型來評(píng)估不同納米藥物的抗腫瘤功效. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案如圖7(a)所示，在注射4T1腫瘤細(xì)胞6天后，將荷瘤小鼠隨機(jī)分為3組：PBS、Taxol和DeP NPs組，給小鼠以15 mg·kg-1的PTX劑量靜脈注射Taxol和DeP NPs，同時(shí)測(cè)量記錄小鼠的腫瘤體積和體重. 系統(tǒng)給藥5次后，在第17天，將小鼠處死. 如圖7(b)所示，PBS組小鼠的腫瘤生長迅速，而DeP NPs和Taxol組的腫瘤生長速度明顯下降. 在治療13天后，DeP NPs和Taxol組小鼠的腫瘤生長受到了有效地抑制. 離體腫瘤的照片和質(zhì)量進(jìn)一步證實(shí)了DeP NPs具有較好的體內(nèi)抑瘤效果(圖7(c)~7(d)). 如圖7(e)所示，采用蘇木精-伊紅(H&E)染色法對(duì)離體的腫瘤進(jìn)行切片染色，DeP NPs組腫瘤切片展示出較多的細(xì)胞核消融. 上述結(jié)果均證實(shí)了DeP NPs具有可媲美Taxol的體內(nèi)抑瘤效果.

Fig. 7  (a) The detailed procedures of the animal treatment. (b) The monitoring of tumor volume of 4T1-suffering mice after intravenously injected with PBS, Taxol, and DeP NPs. (c) Photographs and (d) weight of isolated tumors collected from mice after different treatments, including PBS, Taxol, and DeP NPs. (e) The H&E staining images of resected tumors in the PBS, Taxol, and DeP NPs groups. Statistical P-values: n.s., no significance, **P<0.01, ***P<0.001.

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  接著對(duì)藥物的生物安全性進(jìn)行了考察. 如圖8(a)所示，在治療期間，各組小鼠體重均無較大變化. 血常規(guī)數(shù)據(jù)顯示：治療組除Taxol組的血小板(PLT)有所升高外，均與對(duì)照組相差不大 (圖8(b)). H&E染色結(jié)果也再次證實(shí)了DeP NPs并未對(duì)主要器官組織造成損害(圖8(c))，在當(dāng)前的劑量下，DeP NPs沒有產(chǎn)生明顯的全身毒性.

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Fig. 8  (a) The body weight of mice after intravenously injected with PBS, Taxol and DeP NPs. (b) Blood routine analysis of mice in PBS, Taxol and DeP NPs groups (n=4). (c) H&E staining images of main organs collected from mice in PBS, Taxol and DeP NPs groups.

3 結(jié)論

本文表征了磷脂基載體DPPC和DSPE-PEG擔(dān)載紫杉醇二聚體，對(duì)組裝體的結(jié)構(gòu)、響應(yīng)性、體外細(xì)胞毒性、體內(nèi)抗腫瘤作用和生物安全性的影響. 研究表明：DPPC不利于PTX二聚體的組裝，DSPE-PEG能形成均勻的納米前藥，得到的DeP NPs展示了氧化響應(yīng)的藥物釋放、有效的細(xì)胞毒性、較多的腫瘤蓄積和可媲美Taxol的抗腫瘤活性. 總之，用于擔(dān)載藥物的載體材料對(duì)于提高納米藥物的遞送效率十分重要，該工作可為開發(fā)磷脂基納米藥物及其潛在的臨床應(yīng)用提供重要指導(dǎo).