利用高分子多基元協(xié)同效應(yīng)增強(qiáng)脂質(zhì)體穩(wěn)定性的研究

脂質(zhì)體是磷脂分子通過疏水作用在水溶液中自發(fā)形成的球形組裝體，其水溶性的內(nèi)腔和油溶性的磷脂雙分子層，為遞送不同溶解性的藥物分子提供了良好平臺. 目前，已有多種以脂質(zhì)體為載體的藥物獲得FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床，如：Doxil?、ONPATTRO?等[1]. 研究表明，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性決定了其在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間與到達(dá)作用靶點(diǎn)的載體數(shù)量，從而能夠直接影響藥物治療效果. 因此，提高脂質(zhì)體藥物載體的穩(wěn)定性在藥物載體的構(gòu)建中十分重要[2~6].

脂質(zhì)體的不穩(wěn)定主要是由于脂質(zhì)體膜與血清蛋白、表面活性劑等分子相互作用以及雙分子層自發(fā)的聚集、融合等動(dòng)態(tài)過程所導(dǎo)致的膜融合與破裂[7]. 研究表明，將線性高分子引入至脂質(zhì)體表面形成的水化層，可以對脂質(zhì)體起到良好的穩(wěn)定效果[8]. 很多課題組開發(fā)了基于電中性高分子聚乙二醇(PEG)修飾脂質(zhì)體的載藥平臺，提高了多種載藥體系的穩(wěn)定性[9~12]，降低人體對其清除速率. Ishihara課題組還利用水溶性高分子包被脂質(zhì)體，延長了內(nèi)容物包埋在脂質(zhì)體內(nèi)部的時(shí)間，并通過實(shí)驗(yàn)證明通過加入水溶性高分子可提高脂質(zhì)體在血漿中的穩(wěn)定性[13]. Meland課題組則利用修飾的天然高分子包被脂質(zhì)體，降低了脂質(zhì)體保存過程中的內(nèi)容物外流和脂質(zhì)體聚集[14]. 除了電中性高分子，也發(fā)展了電荷物質(zhì)包被脂質(zhì)體的策略，如Kepczynski課題組通過靜電相互作用使富含正電荷的聚丙烯胺鹽酸鹽衍生物包被含有負(fù)電荷磷脂的脂質(zhì)體膜上，能在血清培養(yǎng)過程中有效阻止血清蛋白進(jìn)入膜內(nèi)導(dǎo)致脂質(zhì)體通透性增強(qiáng)而發(fā)生內(nèi)容物外流[15,16].

在發(fā)展直接引入高分子方法的同時(shí)，科學(xué)家還開發(fā)了原位聚合的策略構(gòu)建高分子包被脂質(zhì)體，提高其穩(wěn)定性. 其中，位于脂質(zhì)體親水表面的原位聚合反應(yīng)可以在膜表面構(gòu)建高分子包被. van Herk課題組利用靜電相互作用在陽離子脂質(zhì)體膜外富集負(fù)電荷分子，通過化學(xué)交聯(lián)的方式原位形成高分子聚合物殼層結(jié)構(gòu)，使其整體結(jié)構(gòu)在Triton X-100條件下能夠得到保護(hù)[17]. Fournier課題組利用聚合酶原位催化磷脂表面DNA鏈增長，在膜上構(gòu)建DNA交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，具有明顯的穩(wěn)定作用[18]. 同時(shí)，科學(xué)家們還開發(fā)了在磷脂膜疏水區(qū)域的原位聚合方法，如：Ringsdorf通過光引發(fā)含碳碳三鍵的磷脂分子在形成脂質(zhì)體后的膜內(nèi)發(fā)生聚合[19]；Meier通過引發(fā)油溶性單體和交聯(lián)劑在磷脂雙分子層內(nèi)聚合形成高分子殼層[20,21]. Aspinwall課題組將乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)通過2,2-二乙氧基苯乙酮(DEAP)的催化作用在磷脂雙分子層中原位形成疏水高分子殼層，并可以有效地抵抗表面活性劑導(dǎo)致的脂質(zhì)體裂解[22]；同樣使用EGDMA并將甲基丙烯酸正丁酯(BMA)單體引入至磷脂雙分子層內(nèi)[23]，原位引發(fā)聚合形成高分子骨架，在提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性的同時(shí)保證了內(nèi)容物的生物活性.

近日，受細(xì)胞膜“細(xì)胞骨架-膜蛋白-脂質(zhì)雙層”原理的啟發(fā)，本課題組提出并開發(fā)了“框架誘導(dǎo)組裝(Frame-Guided Assembly，F(xiàn)GA)”策略[24~27]，在抑制脂質(zhì)體自發(fā)聚集、融合等動(dòng)態(tài)過程方面取得了重要的進(jìn)展. FGA策略利用各種具有精確控制特性的納米材料作為框架，通過將分散的疏水分子錨定在框架上，可以構(gòu)建出不連續(xù)的疏水定位基團(tuán)平面[28]/內(nèi)[29]/外[30]框架，這將進(jìn)一步誘導(dǎo)系統(tǒng)中的兩親分子可控組裝并形成所預(yù)期的二維或三維膜結(jié)構(gòu). 在框架誘導(dǎo)組裝過程中，框架中的定位基團(tuán)表現(xiàn)出了多基元協(xié)同效應(yīng). 在同一框架上且三維分布的定位基團(tuán)與磷脂雙分子層同時(shí)相互作用，因此可在長程范圍有效抑制膜的波動(dòng)和變形，從而大幅度提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性[31~34]，在與血清共培養(yǎng)中表現(xiàn)出良好的單分散性和膜完整性，并作為高穩(wěn)定載體實(shí)現(xiàn)了在藥物遞送方面的應(yīng)用[35].

科學(xué)家們在開發(fā)脂質(zhì)體穩(wěn)定體系和高穩(wěn)定脂質(zhì)體制備策略方面已經(jīng)取得了長足的進(jìn)步，但為了進(jìn)一步發(fā)展長循環(huán)脂質(zhì)體藥物并實(shí)現(xiàn)更多的臨床應(yīng)用，繼續(xù)研發(fā)新的脂質(zhì)體穩(wěn)定體系依然有很大的必要性. 受到框架誘導(dǎo)組裝策略的啟發(fā)，在本工作中，我們合成了接枝了插膜基團(tuán)的線性高分子，利用高分子鏈的多基元協(xié)同效應(yīng)[36,37]，通過簡便的共混復(fù)合策略，制備了具有高穩(wěn)定性高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物. 相較于PEG修飾磷脂在脂質(zhì)體膜外形成水化層從而提高穩(wěn)定性，插膜高分子的每一個(gè)基元之間還存在由高分子主鏈的共價(jià)鍵連接，通過多基元協(xié)同相互作用更大程度上提高了脂質(zhì)體膜的穩(wěn)定性. 該制備策略過程簡單，有效地屏蔽了脂質(zhì)體表面電荷，抑制了電荷介導(dǎo)的融合和表面活性劑對脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的破壞，可以延長脂質(zhì)體在生理環(huán)境下保存時(shí)間. 該復(fù)合策略可有效提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性，在長循環(huán)遞送藥物領(lǐng)域中有廣闊的應(yīng)用前景.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料

1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1,2-二(9Z-油酰)-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二-(9Z-十八碳烯酰)-sn-甘油-3-磷酸-L-絲氨酸(鈉鹽)(DOPS)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)、[N-(7-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑-4-基)-1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(NBD-PE)、N-(麗絲胺羅丹明B磺酰基)-1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(Liss Rhod PE)購于Avanti Polar Lipids, Inc.；8-氨基-1,3,6-萘三磺酸二鈉鹽(ANTS)、1,1'-(1,4-亞苯基雙(亞甲基))雙(1-吡啶鎓)二溴化物(DPX)、去乙?；瘹ぞ厶琴徲赟igma Aldrich公司；膽固醇、異硫氰酸酯熒光素(FITC)購于希恩思公司；N-羥基丁二酰亞胺(NHS)-PEG2000-膽固醇購于Nanocs，Inc.；3-(3-(膽酰胺丙基)二甲氨基)丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)購于Meryer公司；1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7.4)、磷酸鹽緩沖液(PBS) (pH=7.4)、胎牛血清(FBS)購于Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)、D-山梨糖醇購于TCI公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)購于百靈威公司；Zeba Spin Desalting Column 7k MWCO和10k MWCO透析袋購于Thermo Fisher公司；鹽酸阿霉素(DOX)購于源葉生物公司.

1.2 脂質(zhì)體的制備

1.2.1 小型脂質(zhì)體制備

用傳統(tǒng)的薄膜水化方法制備小型脂質(zhì)體. 將磷脂按照配比溶解在氯仿中，加入圓底燒瓶后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(200 r/min，20 kPa，25 ℃)除去有機(jī)溶劑，然后真空干燥至少2 h，以形成干燥的脂質(zhì)薄膜，隨后用緩沖溶液(100 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4或PBS，pH=7.4)水化. 利用囊泡擠出器(Avanti Polar Lipids, Inc.)使溶液反復(fù)通過100 nm聚碳酸酯膜50次來制備大小合適的脂質(zhì)體. 脂質(zhì)體溶液放于4 ℃保存.

1.2.2 巨型脂質(zhì)體制備

巨型脂質(zhì)體(GUVs)由Nanion囊泡制備機(jī)制備. 將質(zhì)量比為45:20:20:15的DOPC、DOPE、DOPS和膽固醇的混合物溶解在氯仿(10 mmol/L, 1 mL)中. 在ITO基板上旋涂混合溶液. 干燥后，將280 μL 1 mol/L D-山梨糖醇溶液添加到干燥的脂質(zhì)膜上. 運(yùn)行基礎(chǔ)囊泡制備方案(5 Hz，3 A，36 ℃，上升時(shí)間=3 min，保持時(shí)間=120 min，關(guān)閉時(shí)間=5 min)，獲得GUV溶液并將其儲(chǔ)存在圓底96孔板中. GUV可在4 ℃保存至少3天.

1.3 插膜高分子的合成與表征

1.34 mg乙二醇?xì)ぞ厶呛? mg NHS-PEG2000-膽固醇分別溶解在1 mL PBS 緩沖液(pH=7.4, 50 mmol/L)中，室溫下混合，反應(yīng)4 h. 在ddH2O中使用10k MWCO透析袋透析3天并凍干后，可獲得終產(chǎn)物[38]. 通過1H核磁共振(1H-NMR)光譜驗(yàn)證膽固醇接枝效果. 為了證明膽固醇接枝聚合物的插膜作用，需合成熒光分子FITC標(biāo)記的高分子. 通過8.1 μL 1.0 mg/mL FITC DMF溶液與1 mL 1.0 mg/mL終產(chǎn)物在常溫下過夜反應(yīng)并透析后制得. 對照組在不添加錨定基團(tuán)NHS-PEG2000-膽固醇的情況下合成.

1.4 高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物的制備

將1.2節(jié)中制得的脂質(zhì)體與1.3節(jié)中制得的插膜高分子混合，使磷脂終濃度為2 mg/mL，插膜高分子終濃度為300 μg/mL. 在室溫條件下靜置15 min，通過膽固醇分子與磷脂分子之間的疏水相互作用，使插膜高分子與脂質(zhì)體形成高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物.

1.5 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)實(shí)驗(yàn)

NBD-PE/Liss Rhod PE和ANTS/DPX在FRET實(shí)驗(yàn)中作為熒光供體-受體對. 脂質(zhì)體融合或破裂后，供體-受體對之間的距離增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng). 向含有2 mL PBS緩沖液的石英比色皿中，加入50 μL帶正電荷磷脂DOTAP和熒光供體與受體標(biāo)記的脂質(zhì)體，攪拌直到獲得穩(wěn)定的基線. 然后，將40 μL含負(fù)電荷磷脂DOPS的脂質(zhì)體(或40 μL含中性電荷磷脂DOPC的脂質(zhì)體)加至比色皿中，使用Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(Agilent Technologies)監(jiān)測熒光信號變化. 含NBD-PE/Liss Rhod PE的FRET實(shí)驗(yàn)中，激發(fā)波長設(shè)置為466 nm，發(fā)射波長設(shè)置為530 nm. 含ANTS/DPX的FRET實(shí)驗(yàn)中，激發(fā)波長設(shè)置為360 nm，發(fā)射波長設(shè)置為510 nm. 狹縫寬度設(shè)置均為10 nm，信號采集間隔均設(shè)置為0.5 s.

熒光強(qiáng)度百分比計(jì)算FI% = (F - Fmin)/(Fmax - Fmin)，F(xiàn)min均為空白對照組的熒光強(qiáng)度最小值，F(xiàn)max在抗表面活性劑實(shí)驗(yàn)中為加入1% Triton X-100后10 min的熒光強(qiáng)度；在抗融合實(shí)驗(yàn)中為加入與DOTAP脂質(zhì)體等摩爾分?jǐn)?shù)的DOPS脂質(zhì)體混合10 min后的熒光強(qiáng)度. F為實(shí)時(shí)監(jiān)測的熒光強(qiáng)度測量值.

1.6 脂質(zhì)體透射電鏡表征

脂質(zhì)體的形貌利用JEOL JEM-1400透射電鏡在 200 kV下進(jìn)行觀察. 在觀察之前，用 7 mg/mL乙酸鈾溶液對樣品進(jìn)行負(fù)染. 制樣方法：10 μL樣品在銅網(wǎng)上沉積并靜置5 min(含有正電荷的磷脂只需靜置1 min)，吸干后用7 mg/mL乙酸鈾染液洗5 s，吸干后再次用7 mg/mL乙酸鈾染液染1 min，吸干后令剩余水分自然揮發(fā).

1.7 脂質(zhì)體動(dòng)態(tài)光散射表征

在石英樣品池中加入20 μL樣品，利用Malvern Instruments公司的動(dòng)態(tài)光散射(DLS)儀器Zetasizer Nano在室溫條件下平衡60 s后開始測量，散射角為90°. 每個(gè)樣品至少測量15次后取平均值.

1.8 脂質(zhì)體表面電荷表征

在樣品池中加入1 mL 1 mol/L NaCl反復(fù)沖洗100次活化電極，加入1 mL磷脂溶液，利用Malvern Instruments公司的Zetasizer Nano儀器，在室溫下測定ζ電位.

1.9 共聚焦顯微鏡表征

將60 μL樣品添加到96孔板中. 使用激光共聚焦顯微鏡，25×水鏡，在激發(fā)波長為488 nm的條件下，F(xiàn)ITC標(biāo)記的高分子將在520~530 nm處顯示綠色熒光.

2 結(jié)果與討論

2.1 高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物的制備與性質(zhì)

通過合成路線示意圖(圖1)中的方法，利用活性酯與氨基的取代反應(yīng)，將膽固醇修飾到殼聚糖上制備插膜高分子，并通過1H核磁共振(1H-NMR)光譜對產(chǎn)物進(jìn)行了表征. 如電子支持信息圖S1，δ=0.85和1.26的特征峰為膽固醇的高場信號，結(jié)合δ=3.69的PEG鏈質(zhì)子特征峰，可以證明膽固醇分子的成功接枝. 通過計(jì)算未去乙酰化的殼聚糖甲基特征峰(―CH3，δ=2.07)、去乙?；腍2(D)特征峰(δ=3.24)和PEG&H2-H8特征峰(δ=3.69)的積分面積，根據(jù)電子支持信息圖S1中公式計(jì)算，膽固醇的接枝率為31%. 我們發(fā)現(xiàn)，在接枝膽固醇后，該高分子仍具有良好的水溶性，可溶于PBS、Tris-HCl等溶液，同時(shí)，高分子中的膽固醇可以通過疏水作用插入脂質(zhì)體膜的磷脂分子層，因此會(huì)使插膜高分子可以貼附于脂質(zhì)體膜表面，為提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).

Fig. 1  Synthesis of glycol chitosan-cholesterol (GCC).

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為驗(yàn)證膽固醇接枝殼聚糖高分子的插膜效果，利用Nanion 囊泡制備機(jī)制備了微米級的巨型脂質(zhì)體(詳見1.2.2節(jié)，明場圖像見電子支持信息圖S2)，通過與插膜高分子共混合的方式使其自發(fā)地形成高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物(圖2(a)). 為了便于表征，通過合成路線示意圖(圖1)所示的方法，利用氨基與異硫氰酸根的加成反應(yīng)，在插膜高分子中引入FITC熒光基團(tuán)，并通過激光共聚焦顯微鏡示蹤插膜高分子. 研究發(fā)現(xiàn)，利用Nanion囊泡制備機(jī)制備的巨型脂質(zhì)體在與插膜高分子孵育15 min后，可以觀察到綠色熒光富集在巨型脂質(zhì)體膜上(圖2(b))，證明了該高分子具有良好的插膜能力. 而當(dāng)用不含有膽固醇的殼聚糖高分子與脂質(zhì)體孵育相同時(shí)間后，溶液中只能觀察到均勻分布的熒光亮點(diǎn)，未出現(xiàn)任何綠色熒光亮環(huán)(圖2(c))，驗(yàn)證了膽固醇基團(tuán)是高分子插膜的重要因素. 以上研究證明了我們制備的插膜高分子可以通過簡單混合的方式，利用膽固醇與膜之間的疏水作用，使其貼附于脂質(zhì)體表面形成復(fù)合物. 在研究插膜高分子與巨型脂質(zhì)體相互作用的同時(shí)，為證明復(fù)合物在后續(xù)生物醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用的可行性，我們也驗(yàn)證了該高分子對于納米脂質(zhì)體膜的復(fù)合效果. 通過將薄膜水化-擠出法獲得的納米級小型脂質(zhì)體(plain liposome)，與插膜高分子混合后制得高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物(GCC-liposome)，由于高分子在脂質(zhì)體表面的富集，粒徑相較于空白對照組的脂質(zhì)體(98.93 nm)有一定的增大(116.22 nm，圖2(d)). 通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)(圖2(e)和2(f))，在加入高分子后，脂質(zhì)體的形貌依然保持著球形的形貌特點(diǎn)，并未出現(xiàn)高分子的聚集及脂質(zhì)體之間的聚集現(xiàn)象，保持了原有的單分散性，且尺寸均一. 在磷脂組成相同、濃度相同的情況下，磷脂分子通過疏水作用形成的磷脂單分子層表面積是固定的. 擠出法制備的脂質(zhì)體磷脂雙分子層分為外層和內(nèi)層，磷脂雙分子層厚度為4 nm. 假設(shè)脂質(zhì)體為正球體，則根據(jù)球表面積公式可得，脂質(zhì)體外表面占總單分子層表面積比例為r2/(r2 + (r - 4)2). 直徑為100~400 nm的脂質(zhì)體，帶入公式計(jì)算可知外表面占比為0.51~0.54，相差不大. 所以我們認(rèn)為脂質(zhì)體的粒徑不會(huì)對膽固醇接枝聚合物的插入量造成明顯的影響. 進(jìn)一步通過測量ζ電位發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的含負(fù)電荷磷脂DOPS的脂質(zhì)體ζ電位為-23.2 mV，加入未經(jīng)修飾的殼聚糖高分子后，ζ電位幾乎保持不變?yōu)?22.0 mV. 在加入修飾了插膜基團(tuán)的殼聚糖高分子后，我們發(fā)現(xiàn)ζ電位有了明顯的升高，達(dá)到-1.78 mV. 以上實(shí)驗(yàn)證明了插膜高分子在小尺寸的脂質(zhì)體體系中依然可以保持良好的插膜效果，并表現(xiàn)出了較好的電荷屏蔽特性，為提高脂質(zhì)體穩(wěn)定及生物應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ).

Fig. 2  Preparation and characterization of polymer-liposome complex. (a) Schematic diagram of the preparation of polymer-liposome complex. Plain liposome is liposome without any modification, while GCC-liposome is membrane-integrated polymer-liposome complex, and GC-liposome is unmodified polymer and liposome mixture; (b) Laser confocal scanning microscope (LCSM) characterization of the integrated polymer-liposome complex; (c) LCSM characterization of the unmodified polymer liposome mixture; (d) Dynamic light scattering (DLS) characterization of liposome; (e) Transmission electron microscope (TEM) characterization of polymer-liposome complex; (f) TEM characterization of unmodified liposome.

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2.2 插膜高分子對納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響

納米脂質(zhì)體作為藥物載體，其穩(wěn)定性決定了體內(nèi)循環(huán)時(shí)間與到達(dá)靶點(diǎn)的載體數(shù)量，影響了藥物治療效果，因此脂質(zhì)體藥物載體的穩(wěn)定性是評判遞藥體系高效與否的重要標(biāo)準(zhǔn)之一. 如前所述，我們制備的插膜高分子與脂質(zhì)體形成復(fù)合物后，利用高分子鏈的多基元協(xié)同效應(yīng)及其對電荷的屏蔽效果，使該體系具有提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性的前景. 脂質(zhì)體的穩(wěn)定性一般表現(xiàn)在抗融合、抗裂解和生理?xiàng)l件下結(jié)構(gòu)完整性，所以我們將從這三方面驗(yàn)證高分子對脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響.

2.2.1 抗融合作用

脂質(zhì)體載體在負(fù)載藥物的過程中，如發(fā)生團(tuán)聚可能會(huì)造成血管堵塞，所以脂質(zhì)體的抗融合是十分重要的. 通過2.1節(jié)中的ζ電位表征發(fā)現(xiàn)，插膜高分子具有良好的屏蔽脂質(zhì)體表面電荷效果，因此可以有效的對抗離子誘導(dǎo)的脂質(zhì)體聚集. 在帶有負(fù)電荷磷脂(DOPS)的脂質(zhì)體溶液中加入終濃度為5 mmol/L CaCl2 (圖3(a))，并連續(xù)檢測高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物和對照組脂質(zhì)體(不含高分子)的粒徑變化和PDI變化. 從圖3(c)和3(d)中發(fā)現(xiàn)，高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物的粒徑在180 min后為(229.39±18.09) nm，PDI平均值為0.15，與初始粒徑(207.9±4.44) nm相比幾乎保持不變. 而未含高分子的脂質(zhì)體在鈣離子的促進(jìn)下，PDI平均值出現(xiàn)明顯的增高，粒徑平均值達(dá)到(1121.38±444.68) nm，與初始粒徑(143.83±1.22) nm相比變化顯著. 通過圖3(e)中所示24和72 h 的透射電鏡表征結(jié)果可以清晰地看到，普通脂質(zhì)體形成了大塊的聚集體，而大多數(shù)高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物依然呈現(xiàn)單分散的形貌特點(diǎn). 此外，觀察到普通脂質(zhì)體在3天的靜置過后，生成肉眼可見的白色沉淀，而高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物溶液依然保持澄清(圖3(b)). 以上實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了通過加入插膜高分子屏蔽脂質(zhì)體的表面電荷，使其在受到二價(jià)陽離子作用的情況下，具有很強(qiáng)的抗融合作用，脂質(zhì)體穩(wěn)定性得到顯著提升.

Fig. 3  Liposome resisting calcium ion-induced fusion. (a) Schematic diagram of charge-induced liposome aggregation, fusion and leakage process; (b) Macroscopic picture after adding calcium ions into plain liposome and GCC-liposome in 3 days; (c) Variation in the liposome particle size after adding calcium ions; (d) Variation in the PDI of liposome after adding calcium ions; (e) (e1) and (e2) are TEM characterizations of plain liposome without any modification. (e3) and (e4) are TEM results of membrane-integrated polymer-liposome complex.

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我們通過含有異種電荷磷脂的脂質(zhì)體融合過程，進(jìn)一步驗(yàn)證插膜高分子對脂質(zhì)體抗融合作用的影響(圖4(a)). 分別制備含有正電荷磷脂DOTAP和負(fù)電荷磷脂DOPS的2種脂質(zhì)體(電子支持信息圖S3和圖S4)，其中在DOTAP脂質(zhì)體中引入了2種在摩爾分?jǐn)?shù)為0.5%條件下可以產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的磷脂分子NBD-PE和Liss Rhod PE. 當(dāng)加入DOPS脂質(zhì)體后，由于電荷相互作用，脂質(zhì)體會(huì)發(fā)生相互的融合，脂質(zhì)體膜上NBD-PE與Liss Rhod PE之間的作用距離增加，熒光共振轉(zhuǎn)移降低，NBD-PE供體熒光強(qiáng)度升高. 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組(含有插膜高分子)與對照組(不含插膜高分子)相比，高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物在抵抗正負(fù)電荷磷脂融合過程中具有一定的穩(wěn)定效果. 如圖4(b)所示，當(dāng)負(fù)電荷磷脂DOPS的摩爾分?jǐn)?shù)為7.5%時(shí)，對照組熒光強(qiáng)度升高至56.17%，實(shí)驗(yàn)組為33.84%；DOPS摩爾分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，對照組熒光強(qiáng)度升高至42.32%，實(shí)驗(yàn)組為22.84%. 隨著負(fù)電荷磷脂DOPS摩爾分?jǐn)?shù)的增加，熒光強(qiáng)度的最終值相應(yīng)升高. 當(dāng)減少插膜高分子的相對濃度時(shí)，熒光強(qiáng)度也相應(yīng)出現(xiàn)了上升. 如圖4(c)所示，高分子終濃度為300、150、75 μg/mL時(shí)，在10 min后熒光強(qiáng)度分別為28.98%、41.69%、63.93%. 這進(jìn)一步證明了插膜高分子對于脂質(zhì)體的穩(wěn)定起到了決定性的作用. 隨后我們對正負(fù)電荷脂質(zhì)體的混合樣品分別進(jìn)行了粒徑和形貌的表征. 如圖4(d)和4(e)所示，在2天的培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)完全沒有任何處理的混合樣品粒徑顯著增加，并在圖4(f)所示透射電鏡表征中觀察到脂質(zhì)體大面積的聚集. 而含有插膜高分子的脂質(zhì)體混合物表現(xiàn)出穩(wěn)定的粒徑大小，在3天的靜置后依然保持著單分散的狀態(tài). 以上實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了，高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物在外部溶液離子強(qiáng)度升高的條件下，可利用其良好的電荷屏蔽能力，降低脂質(zhì)體的相互融合與破裂，有效抵抗電荷誘導(dǎo)的脂質(zhì)體融合過程.

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Fig. 4  Effect of hetero-charged phospholipid on charge-induced liposome fusion. (a) Schematic diagram of the FRET fusion experiment of liposome containing hetero-charged phospholipid; (b) Variation in the FRET fluorescence intensity under different phospholipid composition; (c) Variation in the FRET fluorescence intensity under different integrated polymer contents; (d) Variation in the liposome particle size after mixing of hetero-charged liposome; (e) Variation in the PDI of liposome after mixing of hetero-charged liposome; (f) TEM characterization of mixed hetero-charged liposome.

2.2.2 抗表面活性劑作用

為檢測插膜高分子對脂質(zhì)體破裂釋放內(nèi)容物的影響，通過制備包覆熒光分子ANTS和淬滅劑DPX的脂質(zhì)體，利用FRET原理監(jiān)測其釋放效果. 利用Zeba Spin Desalting Column 7k MWCO去除脂質(zhì)體外未包封的熒光分子和淬滅劑后，可得到在脂質(zhì)體內(nèi)部ANTS和DPX局部濃度分別12.5和40 mmol/L的脂質(zhì)體溶液. 隨后，選用CHAPS作為模型裂解劑，研究了高分子鏈的多基元協(xié)同效應(yīng)對膜的保護(hù)作用. 從示意圖5(a)中可知，脂質(zhì)體溶液熒光強(qiáng)度的上升，是由于熒光分子和淬滅劑從脂質(zhì)體內(nèi)釋放，局部濃度降低，F(xiàn)RET效果減弱，導(dǎo)致體系淬滅效率降低，熒光強(qiáng)度增加. 含有插膜高分子的脂質(zhì)體在加入高濃度的表面活性劑后，與未經(jīng)處理的脂質(zhì)體相比，熒光強(qiáng)度增高得較為緩慢，表現(xiàn)出了一定的穩(wěn)定效果. 我們認(rèn)為這是通過高分子鏈上多位點(diǎn)修飾的疏水基團(tuán)與磷脂分子之間的疏水作用和高分子多基元之間共價(jià)連接的協(xié)同效應(yīng)所導(dǎo)致的. 如圖5(b)所示，表面活性劑終濃度為4 mmol/L時(shí)，對照組在10 min的攪拌過后，熒光強(qiáng)度升高至完全裂解的43.8%，而實(shí)驗(yàn)組為34.6%；當(dāng)表面活性劑終濃度提升至5 mmol/L時(shí)，對照組裂解率達(dá)到65.4%，實(shí)驗(yàn)組為56.4%. 低濃度表面活性劑處理后，實(shí)驗(yàn)組與對照組差別并不明顯. 我們認(rèn)為這是由于膽固醇和殼聚糖主鏈之間還有一段較長的柔性PEG2000，使主鏈的結(jié)構(gòu)剛性無法通過膽固醇的疏水作用傳遞給磷脂膜以達(dá)到顯著提高膜穩(wěn)定性的效果，但這也可以為脂質(zhì)體在受到外界刺激快速響應(yīng)并釋放內(nèi)容物提供一定的幫助. 以上實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了脂質(zhì)體在加入插膜高分子后，可以一定程度上抵抗表面活性劑的裂解作用，對脂質(zhì)體起到一定的穩(wěn)定效果. 提高穩(wěn)定性的脂質(zhì)體依然可以成功釋放內(nèi)容物，為其用作藥物載體的應(yīng)用提供了理論可能.

Fig. 5  The leakage experiment of liposome against surfactant: (a) schematic diagram of the FRET experiment of surfactant-induced liposome leakage; (b) variation in the FRET fluorescence intensity of liposome with different surfactant concentrations.

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2.2.3 血清中插膜高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物的穩(wěn)定性

為驗(yàn)證脂質(zhì)體在復(fù)雜生物體系中的穩(wěn)定性及高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物在長循環(huán)藥物遞送的應(yīng)用可能性，我們在20% FBS中加入含有負(fù)電荷磷脂DOPS和正電荷磷脂DOTAP的脂質(zhì)體，于37 ℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h進(jìn)行一次粒徑和形貌的表征，如圖6(a)和6(b)所示，可以看到，未經(jīng)處理帶有正電荷的脂質(zhì)體與血清中的負(fù)電荷物質(zhì)作用，很快地形成了聚集體，PDI達(dá)到了1.0，粒徑達(dá)到了1200 nm以上. 而含有插膜高分子的正電荷脂質(zhì)體，在3天后依然有一部分保持著單分散的狀態(tài)，PDI小于0.4，為含有正電荷的藥物載體提供了一種在生理?xiàng)l件下保持穩(wěn)定形貌的方法. 含有負(fù)電荷磷脂的脂質(zhì)體在培養(yǎng)過程中粒徑緩慢上升，但依然有部分脂質(zhì)體保持單分散狀態(tài)，加入了插膜高分子后，在脂質(zhì)體單分散性和穩(wěn)定性上有一定的提升效果(圖6(c)). 我們隨后進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過LCSM表征了高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物可以順利進(jìn)入細(xì)胞(電子支持信息圖S5(a))，并通過活死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了負(fù)載DOX分子的高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物可以在細(xì)胞內(nèi)釋放并殺死癌細(xì)胞(電子支持信息圖S5(b)). 以上實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在脂質(zhì)體溶液中加入插膜高分子可以提高其在生理環(huán)境下培養(yǎng)的穩(wěn)定性，保持良好的形貌特征和粒徑大小，在細(xì)胞內(nèi)可釋放并保持藥物活性，這也為未來在藥物遞送過程中延長循環(huán)時(shí)間提供了理論上的依據(jù).

Fig. 6  Incubation of liposome in 20% serum: (a) variation in the PDI of the liposome incubated with 20% serum in 72 h; (b) variation in the particle sizes in 72 h; (c) TEM characterization of liposome in 72 h.

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3 結(jié)論

本文報(bào)道了一種提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性的新方法. 通過構(gòu)建接枝膽固醇的殼聚糖插膜高分子，利用膽固醇和磷脂膜之間存在的疏水作用，形成高分子-脂質(zhì)體復(fù)合物，利用高分子鏈的多基元協(xié)同效應(yīng)，有效提高了脂質(zhì)體在體外環(huán)境下抗融合、抗表面活性劑的能力. 該策略在血清培養(yǎng)中展現(xiàn)了良好的穩(wěn)定性，為未來提高脂質(zhì)體藥物載體的長循環(huán)時(shí)間提供了新思路.