高分子免疫佐劑材料

佐劑是一種添加到疫苗中，使疫苗能夠非特異性地增強機體對抗原的特異性免疫應答的物質，具有誘發(fā)機體產生高效、持久、深遠的特異性免疫反應[1]，減少抗原用量和疫苗接種劑量[2]，提高疫苗穩(wěn)定性和機體免疫耐受性[3]等特點. 早期疫苗，如天花疫苗和牛痘疫苗，以活病毒中提取的病毒核酸及病毒外殼作為佐劑. 直到Pope和Glenny發(fā)現(xiàn)破傷風類毒素能夠被不溶性鋁鹽吸附，這才使得鋁佐劑(尤其是磷酸鋁或氫氧化鋁)成為疫苗中最常用的佐劑之一[4]. 目前，隨著亞單位疫苗的發(fā)展，佐劑的作用顯得尤為重要. 狹義上來講，佐劑是指一些分子佐劑，如模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)激動劑等；但廣義上來講，能夠增強免疫響應的材料都可以被稱為免疫佐劑材料. 因此，佐劑材料的發(fā)展越發(fā)成為疫苗及免疫治療領域的重要前沿和熱點問題.

依托于高分子材料而開發(fā)的新型生物醫(yī)學治療手段正在受到越來越多的關注. 由于其高分子量[5]、豐富的結構可調性[6]以及功能性特點，高分子材料經過組裝形成的納米或微米結構在擔載藥物分子[7]、靶向遞送到生物組織和細胞[8]等方面表現(xiàn)優(yōu)異，已經成為疾病治療和機體系統(tǒng)調控的重要工具. 利用高分子材料來調節(jié)固有或獲得性免疫響應具有很長的先例. 早在1930年，Goebel和Avery就報道過將碳水化合物鍵合到蛋白上形成的糖蛋白能夠調控肺炎球菌疫苗的免疫響應[9,10]；1965年，Scherr等發(fā)現(xiàn)親水聚合物藻酸鹽微/納米顆粒佐劑可以顯著提高抗體滴度[11]，次年，Benet等也報道了聚乙二醇佐劑對4種巴比妥類藥物腸道吸收的影響[12]. 隨著研究人員對高分子結構設計了解的深入，具有固有免疫刺激能力的高分子逐漸被應用到生物醫(yī)學領域中[13]，如組織工程支架、藥物遞送、藥物輔料、抗菌涂層、基因遞送載體等. 越來越多的證據(jù)證明，一些高分子具有固有免疫刺激能力，能夠誘導免疫響應或免疫毒副作用. 這一特征是高分子材料用于生物醫(yī)學時需要被關注的部分，也可以被利用來對機體進行主動的靶向或調控. 實際上，很多天然高分子，如細菌糖肽和單鏈DNA，由于其具有區(qū)別于機體“自我”的，能夠被免疫系統(tǒng)識別為“非我”或“有害分子”的結構特性，正適合作為生物體內的天然免疫原[14,15]. 這類天然的或合成的具有免疫活性的高分子佐劑與小分子佐劑相比，能夠更好地進入細胞，具有更高的與免疫受體結合的能力，并具有更佳的藥代動力學特征，能夠在降低成本的同時實現(xiàn)參數(shù)可調的免疫響應佐劑新途徑.

在本專論中，我們提出了高分子免疫佐劑材料這一概念，并討論了當前以高分子材料為基礎的免疫佐劑材料所取得的進展，進行了代表性應用舉例. 一方面，將介紹本身具有免疫佐劑功能的高分子材料，包括天然高分子免疫佐劑材料和人工合成的高分子免疫佐劑材料；另一方面，將介紹與抗原或佐劑結合的高分子材料，以及其在抗原及小分子佐劑的體內傳輸中所起到的作用. 我們將舉例討論這些材料如何在疫苗及腫瘤免疫治療中發(fā)揮重要作用.

1 免疫應答與佐劑

免疫系統(tǒng)在機體防御外源病原體入侵及調控自體平衡方面扮演著關鍵角色. 據(jù)統(tǒng)計，人體一半以上的疾病都與免疫系統(tǒng)相關，因此，疫苗是人體抵御疾病的重要工具. 接種疫苗的目的是調動機體的免疫系統(tǒng)，使其對外來抗原產生強烈而持久的免疫反應. 哺乳動物先天免疫系統(tǒng)的關鍵功能包括快速識別病原體和/或組織損傷以及向適應性免疫系統(tǒng)的細胞發(fā)出危險信號[16]. 該過程包括抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APCs)如樹突細胞和巨噬細胞捕獲侵入機體的病原體，將其吞噬后分解為較短的肽鏈段，并裝載到主要組織相容性復合體Ⅰ或Ⅱ (MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ)上，將信號呈遞給未成熟的T細胞，從而啟動免疫反應[8,17]. 在此過程中，如果缺乏免疫刺激分子，免疫響應就無法被抗原呈遞過程激活，進而導致T細胞的無效能或耗竭. 而當機體內存在免疫刺激分子時，APCs則能夠被病原相關分子模式(PAMPs)或損傷相關分子模式(DAMPs)經APCs表面、內涵體或細胞質中的模式識別受體激活，并分泌炎性因子，進而活化接受抗原呈遞的T細胞，使其快速做出免疫響應.

獲得性免疫響應也被稱為特異性免疫響應，由T細胞受體(TCRs)和B細胞受體(BCRs)產生，并且僅攻擊曾遇到過的抗原[18]. TCRs在CD8和CD4分子的協(xié)助下，分別結合APCs表面被MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子呈遞的抗原，并產生CD8+細胞毒性T細胞(CTL)來殺傷腫瘤細胞或清除被病原體感染的細胞；或者產生CD4+輔助T細胞分泌炎性因子來增強CD8+T細胞或B細胞的免疫響應. BCRs則主要識別抗原大分子如蛋白或多糖，刺激未成熟的B細胞與抗原結合并在CD4+輔助T細胞分泌的細胞因子的作用下分化成漿細胞，分泌大量的抗體并吸附在病原體表面，使病原體更容易被吞噬細胞吞噬. 不同的細胞因子會使B細胞的抗原表型發(fā)生改變，如從分泌IgM和IgD型抗體轉變?yōu)榉置贗gG2或IgA型抗體[19] (圖1).

Fig. 1  Schematic overview of the adaptive immune response processes. Antigens are processed by antigen presenting cells (APCs) and presented to CD8+ and CD4+ T cells to initiate cellular immune responses through the interaction of major histocompatibility complexes (MHC-I and MHC-II) and T cell receptors (TCRs); during which process, APCs are activated and secrete inflammatory cytokines through the recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) or damage-associated molecular patterns (DAMPs) by pattern recognition receptors (PRRs). B cells could also recognize antigens with the help of CD4+ T cells and translate into plasma cells to secrete antibodies for humoral immune responses.

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固有免疫響應又稱先天免疫響應或非特異性免疫響應，通過模式識別受體識別病原體. 因此在給予抗原的同時給予能夠結合PRRs的免疫刺激劑對于疫苗和免疫治療的實施至關重要. 這些與抗原同時使用的，用于調控免疫響應的分子激動劑就是佐劑. 以往的預防性疫苗主要采用減毒或滅活的病原體，其本身具有PAMPs刺激成分，能夠起到類似佐劑的免疫調控作用[1]；而近年來發(fā)展的亞單位抗原，如多肽抗原和mRNA抗原由于單獨的抗原不足以產生高免疫原性，因此必須添加佐劑來增強其免疫原性[20]. 目前設計合成分子佐劑以引發(fā)特異性的細胞因子釋放進而用于疫苗和腫瘤免疫治療已經成為研究焦點. 然而，分子佐劑經常會造成過度的細胞因子分泌并引起發(fā)燒、注射部位疼痛或其他副作用癥狀，甚至可能引發(fā)炎性因子風暴等致命副作用[21]. 因此，將抗原和佐劑共裝載在同一個遞送載體(如輔助乳液[22]和脂質體佐劑[23])中，實現(xiàn)對于特定的免疫細胞亞型的靶向性，或者在保持疫苗性能的同時降低佐劑給予劑量，對于疫苗的成功是十分必要的. 盡管如此，目前除了鋁佐劑外，只有MF59 (含角鯊烯的水包油乳劑)、AS03 (含角鯊烯、維生素E和Tween80)、含單磷?；|A (monophos-phoryl lipid A, MPL)的AS01和AS02佐劑，以及胞嘧啶鳥嘌呤寡聚脫氧核苷酸(CpG oligo- nucleotide，CpG-ODN)等少數(shù)幾種佐劑被FDA批準應用于人類疫苗. 分子佐劑的臨床試驗中造成的脫靶問題成為限制此類佐劑在疫苗中應用的關鍵.

高分子免疫佐劑材料經過嚴格的早期生物相容性測試，為解決小分子免疫佐劑材料的副作用問題提供了新的思路. 特別是，高分子免疫佐劑材料能夠自組裝形成納米結構，具有與病原體類似的尺寸、形狀、分布等，本身容易被抗原提呈細胞等識別；其次，高分子免疫佐劑材料能夠通過物理包埋或化學鍵合的形式擔載分子佐劑，經過多種分子設計而實現(xiàn)器官選擇性靶向，并可控遞送其所擔載的免疫成分，降低系統(tǒng)暴露[24]，從而能夠為設計新的疫苗和腫瘤免疫治療范式帶來解決思路. 在接下來的部分中，我們將介紹相關方面的一些代表性工作.

2 具有固有免疫刺激活性的天然高分子材料

固有免疫系統(tǒng)能夠識別具有病原體特性的病原相關分子模式，例如細菌脂多糖、未甲基化的CpG DNA，鞭毛蛋白等[25]. 這一類具有免疫佐劑活性的天然高分子能夠從生物質中直接提取而來，并在作為疫苗佐劑用于免疫治療時，發(fā)揮促進抗原呈遞、形成抗原儲庫、調節(jié)免疫響應類型等作用[26]. 例如作為生命體重要組成之一的糖分子既是細胞膜主要結構成分之一，同時又在很多生理識別中扮演重要作用. 目前，多種聚多糖已被證實具有刺激免疫響應的作用，其往往通過與C-型凝集素的結合而發(fā)揮作用. C-型凝集素的定義起初是被用來區(qū)分Ca 2+依賴性和Ca 2+非依賴性碳水化合物結合凝集素的[27]，這些C-型凝集素包括結合甘露聚糖的DC-SIGN、結合β-葡聚糖的Dectin-1、結合唾液酸的唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素(Siglecs)等. 結合C-型凝集素的碳水化合物佐劑與傳統(tǒng)的分子佐劑相比往往具有更低的毒性. 此外，天然來源提取的糖脂分子、皂苷、α-半乳糖基神經酰胺等也能夠經Toll樣受體4 (TLR4)、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 (NLRP3)和CD1d等激活免疫反應. 例如皂苷是一種兩親性的含有萜類分子的寡糖，自1970年以后開始被投入使用，能夠經多種PRRs增強抗原內吞、平衡Th1和Th2響應等[28]；皂苷提取物已經被用于多種佐劑劑型中并獲得批準(如AS01，Matrix-M等)，用于帶狀皰疹、瘧疾與新冠病毒等的疫苗當中[29].

2.1 甘露聚糖(mannan)

甘露聚糖是一種酵母多糖，具有可被巨噬細胞、B細胞和DC上的模式識別受體識別的重復碳水化合物單元[30]，是細胞介導免疫的有效抑制劑. 已有研究人員提出甘露聚糖或甘露聚糖分解代謝物能夠作用于單核細胞或抑制性T淋巴細胞[31]. 甘露糖受體CD206主要存在于巨噬細胞和樹突狀細胞的表面，它是一種I型膜受體，可以結合真菌和其他病原體上發(fā)現(xiàn)的末端甘露糖，并介導巨噬細胞對糖蛋白的內吞，已被證明可介導對真菌抗原的體外細胞免疫反應[32,33]. 這一特點使得甘露聚糖能夠經受體或漿細胞DC (pDC)的主動轉運作用而增加疫苗向淋巴結的聚集. 此外，甘露聚糖自身還具有激活TLR4的作用. 利用甘露聚糖的這些特性，以甘露聚糖為殼，聚乳酸-聚乙烯亞胺(PLA-PEI)為核組裝制備納米顆粒疫苗，蛋白抗原和Toll樣受體9 (TLR9)激動劑CpG通過靜電相互作用吸附在PLA-PEI內核上. 我們發(fā)現(xiàn)，甘露聚糖修飾可以大大增強納米顆粒疫苗的淋巴結引流能力，并且甘露聚糖本身作為TLR4激動劑可以與 CpG 協(xié)同最大程度地激活 DC，從而誘導強有力的抗腫瘤免疫反應[34].

2.2 β-葡聚糖

β-葡聚糖是真菌細胞壁中發(fā)現(xiàn)的β1→3和β1→6連接的聚多糖，其能夠被CD3、Dectin-1和TLR2等多種免疫受體識別. C型凝集素Dectin-1是一種β-葡聚糖受體，存在于巨噬細胞上，可以識別各種β-葡聚糖[35,36]. 由于β-葡聚糖的易獲得性、低毒性，以及可以形成納米顆粒等特性，以β-葡聚糖為原料制備的疫苗制劑具有很多優(yōu)于傳統(tǒng)佐劑的特點. Seong等發(fā)現(xiàn)，用β-葡聚糖刺激巨噬細胞會增加腫瘤壞死因子-α (TNF-α)的表達. 當用β-葡聚糖和脂多糖(LPS)共同刺激細胞時，可以通過增加的TNF-α表達觀察到協(xié)同效應. 在白細胞介素-6 (IL-6)表達中，任何β-葡聚糖本身不能誘導IL-6表達. 然而，當β-葡聚糖和LPS發(fā)生共刺激時，細胞通過增加IL-6表達顯示出強烈的協(xié)同作用. 這說明了β-葡聚糖能夠增加免疫調節(jié)基因的表達，并顯示出與LPS的協(xié)同作用[36]. 目前，將β-葡聚糖應用于臨床的主要障礙是合成和分離具有精準明確結構的β-葡聚糖，這仍是高分子化學家需要解決的問題.

2.3 殼聚糖

殼聚糖是一種從甲殼素中提取的多糖，其作為可溶性蛋白質的輸送系統(tǒng)具有相當大的潛力. 它是一種由具有正電荷的，β1→4葡萄糖胺連接的天然高分子材料，具有良好的生物相容性. 殼聚糖的局部鼻內、皮下、眼部或局部給藥通常是安全的，副反應癥狀輕微[37]. 此外，殼聚糖能夠通過一系列固有免疫識別受體促進DC成熟并分泌I型干擾素. 2011年，Heffernan等的研究使用了黏性殼聚糖溶液和IL-12 (一種 Th1 誘導細胞因子)開發(fā)了一種疫苗佐劑系統(tǒng). 皮下注射后發(fā)現(xiàn)，殼聚糖/IL-12/OVA 疫苗能顯著提高CD4+脾細胞增殖、Th1細胞因子釋放、CD8+ T 細胞干擾素-γ(IFN-γ)釋放和MHC I類肽的量，從而引發(fā)更強烈的抗原特異性 CD4+和 CD8+T 細胞反應. 殼聚糖和 IL-12 的組合還能增強IgG2a 和 IgG2b抗體對OVA 的反應，進而促進模型蛋白疫苗誘導的 Th1 免疫反應的產生[38]. 殼聚糖誘導Th1免疫反應的機制是殼聚糖能夠增加線粒體壓力和活性氧的產生，導致線粒體DNA向細胞質中的泄露，最終活化胞質中的cGAS-STING通路生成I型干擾素(IFN-I)[39]. 除了STING通路，殼聚糖還被報道能夠活化NLRP3炎性小體通路，與TLR2、TLR4和巨噬細胞甘露糖受體(MMR)等多種PRRs結合，并形成抗原儲庫來發(fā)揮佐劑功能[40]. 除此之外，多項研究還證實殼聚糖能夠增強黏膜免疫，從而可以用于吸入疫苗的設計，這得益于殼聚糖所帶的正電荷能夠幫助它更高效地穿過黏膜而遞送抗原和刺激固有免疫響應[41]. 與其他多糖一樣，殼聚糖復雜的多價結構導致機制研究的困難，對于殼聚糖在疫苗佐劑中的轉化問題仍需要進一步研究.

3 具有固有免疫刺激活性的合成高分子材料

合成高分子材料作為藥物傳輸材料通常不具有免疫活性，但近年來的一些研究則發(fā)現(xiàn)一些合成高分子材料本身就能夠作為危險信號而激起免疫響應[42]. 隨著PRR識別機制在分子層面被更好地理解，合理設計合成的高分子材料可以可控地打破細胞器穩(wěn)態(tài)、與天然受體相互作用、并引發(fā)固有免疫刺激活性. 這類具有PRR功能的合成高分子材料相比傳統(tǒng)的PRR小分子激動劑具有低成本、高可調性和與現(xiàn)有疫苗或免疫治療體系的兼容性更好[6~8]等優(yōu)勢，彰顯了良好的轉化前景. 當前報道較清楚的兩類能夠被合成高分子作為危險信號激活的PRR通路是STING和NLRP3受體，這可能是由于這兩個通路與其他的模式識別受體不同，它們位于細胞質當中，并且具有更廣泛的識別能力(而其他模式識別受體的專屬性更強).

3.1 活化STING通路的合成高分子

干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)是一類位于內質網上，對固有免疫具有強烈激活作用的適配蛋白，它在識別細胞質中的雙鏈DNA (dsDNA)后被激活，在一系列過程作用下引發(fā)I型干擾素的分泌[43]. STING通路的活化通常包括兩個步驟，一是環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cGAS)與胞質中的dsDNA結合后催化三磷酸腺苷(ATP)和三磷酸鳥苷(GTP)合成“第二信使”——環(huán)二核苷酸(2'3'-cGAMP)或其他環(huán)二核苷酸，如環(huán)狀-di-AMP(c-di-AMP)或c-di-GMP[44,45]，之后這些環(huán)二核苷酸(統(tǒng)稱為CDNs)與內質網上的STING蛋白域結合，使STING蛋白構象發(fā)生改變，并從內質網遷移到高爾基體，聚集形成STING蛋白多價聚集體，最終招募下游TBK1和IRF3，并使其發(fā)生磷酸化，驅動IFN-I相關的干擾素刺激基因(ISGs)的轉錄[46,47] (圖2(a)). 利用STING激動劑來發(fā)展腫瘤疫苗的優(yōu)勢在于STING通路主要刺激干擾素產生從而引發(fā)Th1型CTL響應，而較少產生容易帶來炎性副作用的炎性因子，可以在高效激活免疫的同時減低炎性副作用.

Fig. 2  The cGAS-STING pathway and related polymeric stimulants. (a) Mechanism of cGAS-STING pathway; (b) Screening of azole molecules tethered branched polyethylenimine (PEI-M) as polymeric STING agonists (Reprinted with permission from Ref.?[51]; Copyright (2022) Wiley‐VCH GmbH).

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盡管小分子仍是STING激動劑研發(fā)的主要類型，近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)一些合成高分子材料也具有STING激活功能. Shae及其課題組的同事為了解決小分子環(huán)二核苷酸細胞靶向性差、清除速度快和向 STING 定位的細胞質的轉運效率低等問題，設計了具有pH響應、膜去穩(wěn)定活性的聚(乙二醇)-嵌段-((2-(二乙基氨基)甲基丙烯酸乙酯)-co-(甲基丙烯酸丁酯)-co-(吡啶基二硫化物甲基丙烯酸乙酯))聚合物納米囊泡，用于激活STING通路. 該聚合物納米囊泡能夠增強腫瘤微環(huán)境和前哨淋巴結中的 STING 信號傳導，使得cGAMP 被有效地封裝到囊泡當中，而在進入溶酶體后則會在酸性條件下而分解解體，從而實現(xiàn)增強的 STING通路內源性環(huán)二核苷酸配體的胞質遞送[48]. 此外，美國西南醫(yī)學中心的高金明課題組也報道了一種聚乙二醇嵌段聚甲基丙烯酸甲酯鍵合七元環(huán)胺(PC7A)的結構，其被發(fā)現(xiàn)能夠與STING蛋白直接結合而引發(fā)STING蛋白的聚集以及下游TBK-1活化和I型干擾素的產生. 該研究證明，PC7A作為疫苗載體表現(xiàn)出比傳統(tǒng)小分子佐劑更好的治療效果. 重要的是，由于STING激活主要產生的是I型干擾素而較少產生IL-6等炎性因子，采用STING激動劑作為疫苗佐劑能夠帶來的副作用更小. 此外，由于PC7A與STING的結合位點與內源環(huán)二核苷酸并不相同，PC7A能夠與2',3'-cGAMP聯(lián)合作為雙STING激動劑治療，在多種腫瘤模型上表現(xiàn)出出色的腫瘤治療效果[49,50]. 我們的研究團隊則篩選了一系列五元含氮雜環(huán)小分子及其苯并結構，將其鍵接到支化聚乙烯亞胺上，發(fā)現(xiàn)這一結構體系(PEI-M)也可以刺激細胞內STING通路的活化及I型干擾素的分泌；而小分子和支化聚乙烯亞胺本身并不具備這樣的刺激活性[51](圖2(b)). 這一結果證實，含氮雜環(huán)結構小分子修飾的高分子材料可能是一類潛在的STING激動劑材料. STING作為一種位于細胞質中的內源性受體，除了識別天然cGAMP小分子而激活外，還能夠被人工合成的聚合物材料所激活，這一發(fā)現(xiàn)非常有趣，也為開發(fā)基于合成高分子材料的免疫佐劑帶來了新思路.

3.2 活化NLRP3的合成高分子

NLRP3是一種細胞內傳感器，主要分布于間質及細胞膜中，參與多種宿主免疫和炎癥反應. 與其他PRR不同，NLRP3在包括線粒體上積累的活性氧[52]、機體內結晶物質如單鈉尿酸鹽(MSU)晶體、二水焦磷酸鈣(CPPD)晶體、膽固醇晶體[53,54]，以及ATP[55]等多種刺激下都會發(fā)生構象的轉變和活化. NLRP3被激活后，會發(fā)生蛋白質結構的轉變，暴露嘧啶核苷(PYD)，并結合凋亡相關ASC和pro-caspase-1，形成NLRP3炎性小體，剪切產生有活性的Caspase-1，促進IL-1β和IL-18的分泌以及細胞焦亡的發(fā)生[56] (圖3). NLRP3炎性小體在多種疾病中都扮演重要角色，如痛風[53]、動脈粥樣硬化[55]、肥胖和阿爾茲海默癥[57]等，也被認為是疫苗和免疫治療的重要靶點.

Fig. 3  The NLRP3 inflammasome pathway.

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利用合成高分子來活化NLRP3炎性小體作為佐劑并用于生物治療是很吸引人的，可以解決小分子激動劑的來源困難、免疫毒副作用等問題. 近年來發(fā)現(xiàn)陽離子聚合物能夠通過內涵體、溶酶體的破壞而活化NLRP3炎性小體. Turley等報道了一種脫乙酰化的殼聚糖，它是一種陽離子多糖，具有生物相容性和可生物降解的性質[58]. 該研究證明，脫乙?；臍ぞ厶悄軌蛘T導NLRP3炎性小體活化并分泌IL-6、IL-1β等細胞因子. 離子聚合物被細胞吞噬后能夠插入內涵體的膜表面，在內涵體酸化過程中導致膜的破裂，并通過質子海綿效應和內涵體逃逸實現(xiàn)NLRP3炎性小體的活化. 通過調節(jié)聚合物的性質來調控內涵體的裂解程度是精準控制NLRP3炎性小體活化的有效手段. 例如：Esser-Kahn的研究組發(fā)現(xiàn)樹枝狀骨架包含不同比例的陽離子氨基酸和四(乙烯乙二醇)結構域能夠調節(jié)內涵體和溶酶體的間充質壓力，從而控制下游Caspase1和IL-1β的活性[59] (圖4(a))；Baljon等報道pH響應聚合物中丁基甲基丙烯酸酯與2-二甲氨基乙基乙酸酯的比例能夠調節(jié)內涵體破裂和炎性小體活化的程度[60]；Nandi等報道聚乙二醇嵌段香豆素甲基丙烯酸甲酯和辛基丙烯酸甲酯中的烷基鏈的含量同樣會影響內涵體破裂的速率以及炎性小體的活化情況[61] (圖4(b)). 上述結果證實聚合物結構中的微小改變即會對其活化NLRP3炎性小體的活性產生影響，這也為篩選具有不同需求的高分子佐劑材料提供了可能.

Fig. 4  Precisely control the activation of the NLRP3 inflammasome by regulating the properties of the polymers. (a) Structure of dendritic lysines capped by histidine and tryptophan and cofunctionalized by TEG chains (efficiently/inefficiently ruptures lysosomes) (red, histidine; blue, tryptophan) and proposed mode of action (Reprinted with permission from Ref.?[59]; Copyright (2018) American Chemical Society); (b) Polymer structure of a core hydrophobicity nanoparticle-associated-molecular pattern (NAMP) responsible for activating NLRP3 inflammasome (Adapted from permission from Ref.?[61]; Copyright (2021) American Chemical Society).

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4 鍵合或擔載抗原的高分子佐劑材料

高分子材料作為載體材料擔載藥物用于藥物的靶向傳輸、可控持續(xù)釋放等，在過去得到了大量的研究，已有多種多樣的敏感鍵合方法、組裝結構，以及智能響應設計被報道出來[62~65]. 在免疫治療當中，利用高分子材料進行化學鍵合，或者物理擔載免疫原性成分可以充分發(fā)揮高分子的多價效應、遞送功能和緩釋功能等，從而實現(xiàn)一種或多種免疫成分的增效協(xié)同并降低免疫成分的免疫相關副作用，并使得高分子材料成為新型的更有潛力的免疫制劑類型. 在本部分中，我們將介紹化學鍵合及物理擔載免疫激動劑藥物的例子.

4.1 高分子材料共價鍵合免疫佐劑提升免疫佐劑活性

利用高分子材料共價鍵合免疫佐劑為設計具有精準化學結構和分子組成的高分子免疫佐劑提供了一種有吸引力的方法. 高分子材料可以被設計為線性的、樹枝狀的或超支化的大分子，用于滿足不同情況下的載體需求. 例如：為了使疫苗實現(xiàn)對于多種抗體(體液免疫)和CD8+T細胞反應(細胞免疫)的激發(fā)，Hubbell的研究組設計了一種高分子藥物偶聯(lián)物——p(Man-TLR7) 的合成糖佐劑，這種高分子佐劑能利用靶向甘露糖結合C型凝集素的優(yōu)勢來有效地協(xié)同傳遞抗原和聚合佐劑，從而增強疫苗的免疫效率[66]. 首先，他們將含有TLR7激動劑的甲基丙烯酰胺單體和含有甘露糖的甲基丙烯酰胺單體進行可逆加成-斷裂鏈轉移聚合(RAFT)，制備得到了免疫活性聚合物p(Man-s-TLR7)，再經自斷裂連接鍵與模型抗原OVA蛋白偶聯(lián)得到疫苗. 該疫苗在體外實驗中展現(xiàn)出良好的內吞能力和將抗原呈遞給T細胞的能力，并且能很好地靶向DC細胞或通過TLR7激活DC. 在經過糖基化處理后，該疫苗與缺乏甘露糖靶向或TLR7配體的聚合物偶聯(lián)的OVA相比，激發(fā)了更顯著的體液和細胞免疫. 在利用模型抗原OVA證實這一特征后，作者將瘧疾的環(huán)子孢子蛋白抗原CSP與p(Man-TLR7)綴合，并與由 CSP和脂質體組成的制劑進行比較，結果表明，只有CSP-p(Man-TLR7)疫苗組產生了CSP特異性CD8+ T細胞免疫反應，表現(xiàn)為TNFα+、IFN-γ+、CD8+ T細胞的百分比的顯著增加，同樣證實了這一鍵合設計在增強抗原特異性T細胞和B細胞免疫方面的作用.

Lynn和Laga等將小分子TLR7/8激動劑R848通過噻唑啉-2-硫酮鍵合到聚N-(2-羥基丙基)甲基丙烯酰胺骨架上，得到溫度響應聚合物-鍵合TLR-7/8a，并將其作為疫苗佐劑用于靈長類動物實驗中[67]. 作者詳細研究了免疫激動劑的接枝密度、電荷、納米組裝形式等對于該材料的免疫活性的影響，證實大分子免疫佐劑材料的物理化學性質對于材料免疫原性影響的重要性. 除了線性聚合物，樹枝狀大分子也可以用來鍵合抗原和佐劑，特別是樹枝狀大分子的結構能夠增加溶解性并將佐劑暴露在表面. 例如：Wang及合作者們最近報道了一種負載有光敏劑二氫卟酚e6 (Ce6)的缺氧響應性兩親聚賴氨酸樹枝狀大分子(HAD)納米顆粒，該疫苗在近紅外光照射下，不僅誘導腫瘤細胞裂解和腫瘤抗原釋放，而且促進含有2-硝基咪唑的樹枝狀大分子結構轉化為含有2-氨基咪唑的樹枝狀大分子，通過TLR7激活DC信號通路. 其能夠有效抑制原發(fā)性和異位腫瘤生長，并誘導強烈的抗原特異性免疫記憶效應，以防止體內腫瘤轉移和復發(fā)，對于多種腫瘤表現(xiàn)出了非常強的治療效果[68].

4.2 非共價策略來增強抗原的免疫原性

通過組裝以非共價策略來制備佐劑材料是另外一種增強抗原及佐劑免疫原性的方式. 這一策略的好處是可以使用廉價可獲得的初始材料來制造新的佐劑材料，并且可以通過實現(xiàn)疫苗遞送的靶向性而降低現(xiàn)有小分子佐劑的毒性. 例如：TLR7/8激動劑咪喹莫特因注射后的系統(tǒng)毒性而影響了其作為疫苗佐劑的臨床轉化，而脂質衍生咪喹莫特并吸附于鋁佐劑上的3M-052佐劑的安全性則能夠得到保障，其作為流感預防性的疫苗研究已經進入臨床試驗. 這顯示了利用自組裝的納米材料提升現(xiàn)有佐劑能力方面的巨大潛力[69,70].

常見的自組裝納米遞送系統(tǒng)如脂質體、脂質納米顆粒、膠束、聚合物囊泡等在近年來用于藥物傳輸方面吸引了大量的關注. 這些納米遞送體系具有自組裝穩(wěn)定、制備工藝成熟、生物安全性良好、能夠穩(wěn)定裝載所擔載的藥物并隨時間可控釋放等獨特優(yōu)勢；且由于其具有兩親性質，既可以裝載疏水藥物分子，也可以裝載親水藥物分子. 例如：基于脂質納米顆粒的mRNA新冠疫苗mRNA-1273已經在2021年獲得批準；在這一體系中，Baden等制備了可離子化的脂質納米載體封裝的mRNA疫苗，并進行了一系列臨床試驗. 研究證明，這種疫苗在內吞進入細胞后，可以保護mRNA免于被降解，能夠幫助mRNA實現(xiàn)向細胞質中的逃逸[71,72]. 相比于脂質體和脂質納米顆粒，基于高分子材料的膠束或高分子囊泡具有更好的穩(wěn)定性. Dowling和Scott等為了解決新生兒存在的過度的免疫反應問題，開發(fā)了針對年齡特異性的疫苗制劑. 他們合成了一系列基于聚乙二醇嵌段聚丙烯硫醚的聚合物囊泡擔載抗原和小分子TLR8激動劑；他們比較了不同的聚合物囊泡尺寸與疫苗免疫原性的關系，將其與減毒疫苗進行對比并發(fā)現(xiàn)，當聚合物囊泡的尺寸與減毒活疫苗的尺寸相當時，疫苗能夠產生最強的固有和獲得性免疫響應[73].

免疫佐劑材料擔載免疫活性物質所形成納米組裝體的物理化學性質對于最終的疫苗產生的免疫刺激活性和生物安全性具有重要影響. 例如：納米粒子的尺寸會影響顆粒到達淋巴結的方式：大的顆粒(>500 nm)會在注射部位形成抗原儲庫，并等待組織中的APCs來吞噬和加工抗原；小的顆粒(<100 nm)則可以快速回流到淋巴結并被淋巴結內的APCs加工呈遞；可溶的抗原或佐劑(<10 nm)則會快速進入血液循環(huán)，引發(fā)脫靶副作用[74~76]. 除了尺寸影響，相同尺寸納米顆粒的形狀、電荷、表面形貌等也會對免疫響應產生影響. 例如：Mitragotri及其課題組的成員證明了納米粒子的形狀在抗原的吞噬和加工過程中扮演著重要角色：小尺寸的、球形的粒子(類似于天然病原體結構的)往往表現(xiàn)出更高效地被APCs吞噬的效率；相反，高縱橫比的材料會導致較差的細胞內吞和細胞損傷(可能是由于導致NLRP3炎性小體的活化)[77,78]. 除此之外，電荷也能夠影響高分子免疫佐劑的活性. 陽離子聚合物如聚乙烯亞胺(PEI)、聚(2-氨乙基丙烯酸甲酯) (PAEMA)、聚(N,N′-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸甲酯)(PDMAEMA)、聚精氨酸等已被用于與帶有負電荷的PRR激動劑如CpG(TLR9激動劑)、Poly(I:C)(TLR3激動劑)等復合并提升細胞內吞和胞質傳輸. 這些陽離子聚合物能夠幫助實現(xiàn)更加有效的胞質傳輸、增加抗原交叉呈遞向MHC-I及CTL response的發(fā)生，以及實現(xiàn)mRNA或DNA的基因或疫苗遞送等. 此外，聚合物材料的表面紋理對于免疫活性也是有影響的. 例如：Kurt-Jones的研究組證實具有粗糙表面的聚苯乙烯納米顆粒能夠比具有平滑表面的粒子引發(fā)更強的免疫刺激活性及中性粒細胞的浸潤[79]. 謝曦及其小組的工作以微生物表面的拓撲特征對免疫反應的影響為靈感，制備了具有納米尖刺的裝飾的微粒，證明了納米尖刺對細胞施加機械應力，能夠導致吞噬過程中巨噬細胞和DC中的鉀外流和炎癥小體激活，進而顯著增強抗原特異性體液和細胞免疫反應，并引發(fā)針對腫瘤生長和流感病毒感染的保護性免疫[80]. 更多參數(shù)對于免疫活性影響，仍然是值得研究的問題.

中山大學陳永明課題組開發(fā)了一種快速納米絡合(FNC)技術，用于制備治療性納米疫苗. 首先，為了治療人類慢性乙型肝炎，陳永明課題組開發(fā)了一種基于殼聚糖-肝素的治療性納米疫苗，這種疫苗包括載有重組乙型肝炎表面抗原HBsAg (rHBsAg)和CpG的納米疫苗(NSG)以及載有重組乙型肝炎核心抗原HBcAg (rHBcAg)和CpG的納米疫苗(NCG). 實驗結果證明，聯(lián)合給藥的納米疫苗可以打破免疫耐受，實現(xiàn)HBsAg血清清除和抗HBsAg抗體(HBsAb)血清轉化，并在HBV攜帶小鼠中誘導有效的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應[81]. 由于半柔性蠕蟲狀納米粒子在穿過淋巴管內皮細胞和穿透淋巴結內的細胞外基質 (ECM) 到達運輸中的免疫細胞方面表現(xiàn)出的獨特特性，陳永明課題組設計了一種蠕蟲狀納米佐劑控制疫苗，這種疫苗采用載有CpG的定制大小和縱橫比的聚合物分子刷作為納米佐劑，并證明這種定制佐劑的納米疫苗更容易內化到APC中，并在TLR9所在的晚期內涵體中積累[82]. 為了實現(xiàn)納米粒子在淋巴結中的長時間保留，使抗原或分子佐劑延長釋放，作者進一步設計了一種單寧酸(TA)修飾的TLR7/8激動劑咪喹莫特納米疫苗. 經TA修飾的納米粒子增加了疫苗向淋巴結中轉移性腫瘤部位的遞送，在那里腫瘤相關抗原被釋放并由導管襯里的DC呈遞以激活T細胞. 沉積到淋巴結導管的納米粒子在預防三陰性乳腺癌細胞的淋巴血管侵襲和隨后的肺轉移方面表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能[83]. 為了解決CpG激動劑在給藥后引發(fā)的全身毒性問題，作者團隊使用FNC技術，將生物相容性魚精蛋白和三聚磷酸鹽(TPP)通過物理交聯(lián)生成納米顆粒，并將CpG封裝在魚精蛋白和TPP的物理交聯(lián)網絡中. 實驗結果表明，納米佐劑可以將CpG重定向到引流淋巴結中，以減少全身擴散，從而提高安全性[84].

除了預先自組裝成納米結構以外，基于聚合物的微球、宏觀植入件或水凝膠也被用作新型的免疫佐劑材料[85~89]. 2020年，馬光輝研究組報道了一種用于高性能癌癥疫苗接種的新型自愈微膠囊制劑. 首先將抗原分子以后擴散方式加載到基于聚乳酸(PLA)的微球中，再通過密封過程使微球表面的孔隙愈合，得到載有抗原的微膠囊. 接種疫苗后，這些微膠囊能夠留在注射部位并形成抗原庫. 伴隨著微膠囊降解和抗原的持續(xù)釋放，APC募集可以得到有效實現(xiàn)，進而使抗原內化持續(xù)增加. 其次，微膠囊降解產生的乳酸創(chuàng)造的酸性環(huán)境進一步促進了抗原的吸收、交叉呈遞、APC招募和APC激活，使得這些APC歸巢于淋巴結并持續(xù)誘導T細胞攻擊腫瘤細胞[90]. Mooney及其同事使用聚(丙交酯-乙交酯)和生物活性分子(GM-CSF和CpG-ODN)進行研究，設計了一種能夠用于規(guī)劃和控制體內各種類型細胞運輸?shù)妮d體材料[91]. 他們希望設計的高分子佐劑不僅能作為藥物傳遞裝置，而且作為一個物理的抗原提呈結構，使樹突狀細胞能夠被招募到其中，且在被激活時能駐留于此. 也就是說，使構建的疫苗可以作為一座“倉庫”(depot)，縮減疫苗治療的時間、費用和繁瑣的流程，實現(xiàn)在不需要多次注射和高藥物負荷的情況下達到良好的治療效果. 我們圍繞這一問題也進行了相關研究，基于我們之前報道的動態(tài)共價水凝膠技術[87,92]，我們提出了一種個性化癌癥疫苗開發(fā)策略，即基于動態(tài)共價水凝膠的疫苗(DCHVax)，將氧化葡聚糖和八臂氨基聚乙二醇混合在一起制備水凝膠，并在此過程中將蛋白抗原和佐劑加載到水凝膠中，用于術后腫瘤治療，由于該系統(tǒng)能夠持續(xù)穩(wěn)定緩釋所擔載的抗原和佐劑，延長免疫刺激所維持的時間，有效地激活了抗腫瘤免疫響應，在幾種小鼠腫瘤模型中都有效抑制了殘留腫瘤的術后生長[93].

在疫苗作用過程中，抗原持續(xù)釋放時間情況往往會決定疫苗所產生的免疫效果. 例如：Appel研究組報道的聚合物-納米顆粒水凝膠系統(tǒng)，包含十二烷基修飾的羥丙基甲基纖維素為基質擔載PEG-PLA納米顆粒[94]. 這一系統(tǒng)可以擔載親水及疏水的藥物并具有剪切變稀性質，可以經注射器注射進入體內. 當擔載親水模型抗原蛋白及疏水的TLR3激動劑時，其可以表現(xiàn)出儲庫效應而在注射部位持續(xù)緩釋達1周左右，從而在不經加強針的情況下可以維持抗體響應達90天以上. 這種局部緩釋劑型可以增強疫苗的依存性和疫苗使用的簡便性，通過控制抗原及佐劑的緩釋時長和動力學，可以進一步加強疫苗的免疫效果. 在2021年，Appel研究組進一步開發(fā)了一種可注射的聚合物納米顆粒(PNP)水凝膠系統(tǒng)，用于疫苗抗原貨物RBD的持續(xù)遞送[95]. 具體來說，作者使用了混合疏水改性的羥丙基甲基纖維素衍生物(HPMC-C12)和由聚(乙二醇)-b-聚(乳酸)制成的可生物降解聚合物納米粒子(NP)制備了溫和穩(wěn)定、便于注射、快速自愈且具有足夠屈服能力的水凝膠疫苗載體，并擔載RBD抗原，證明了該疫苗佐劑系統(tǒng)能夠很好地解決由于RBD體積小而造成的低效的淋巴吸收問題，增強RBD與關鍵免疫細胞的相互作用，并顯著提高了體液免疫的激活水平. 康奈爾大學的馬明林小組也進行了相關的研究[96]. 作者報告了一種高親和力可注射水凝膠支架，通過程序分析聚合物的晶體結構與RBD側鏈官能團之間的親和力大小，確定使用聚(N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺)-co-(N-(三(羥甲基)甲基)丙烯酰胺) (p(APMA-THMA))制備水凝膠疫苗佐劑，用于RBD抗原的遞送. 實驗結果表明，該水凝膠支架能夠誘導有效的生發(fā)中心(GC)反應，且該反應與RBD特異性抗體的產生和強大的1型T細胞反應相關. 這證明了除了作為持久的RBD儲存器外，該水凝膠支架還成為先天免疫細胞激活的局部位點，實現(xiàn)更簡單，更強烈的免疫反應.

5 結論與展望

疫苗是人類醫(yī)學史上最偉大的發(fā)明之一. 1798年，英國醫(yī)生愛德華·詹納通過接種牛痘幫助人類預防天花，開啟了現(xiàn)代疫苗科學[97]；二百多年來，全球已經批準了92種疫苗，用于預防24種病毒和16種細菌的感染和復發(fā). 疫苗技術的出現(xiàn)大大延長了人類的平均壽命，也使得大規(guī)模的城市人口聚集成為可能. 佐劑是指能夠增強免疫應答或改變免疫應答類型的物質. 作為疫苗的重要組成部分，佐劑能夠激活抗原提呈細胞、保護抗原免被降解、提升抗原的傳輸效率等，為疫苗抗原發(fā)揮預防和治療作用發(fā)揮了關鍵作用. 時至今日，疫苗的概念正在從預防性疫苗向治療性疫苗如腫瘤疫苗、自體免疫疾病疫苗、代謝病疫苗等方向進展，疫苗抗原的類型也在從傳統(tǒng)的減毒或滅活病原體向重組蛋白、多肽、mRNA等亞單位抗原類型轉變[20]. 盡管這些亞單位抗原更加精確和安全，但是其免疫原性和穩(wěn)定性也隨之降低，這就使得佐劑材料的運用在現(xiàn)代疫苗技術中起到越來越重要的作用. 此外，現(xiàn)有疫苗技術在很多感染與疾病面前仍然無能為力，疫苗的給予途徑可能也會對疫苗刺激產生的免疫效力帶來重要影響[98,99]，而這些都依賴于新型佐劑材料的發(fā)展.

高分子免疫佐劑材料，是通過高分子材料來提升免疫佐劑的安全性和有效性，或者設計全新的具有免疫刺激活性的大分子佐劑，有望解決現(xiàn)有小分子免疫佐劑存在的免疫副作用大、臨床應用受限的問題，這對于疫苗及新型腫瘤免疫療法的發(fā)展都至關重要. 然而，由于疫苗應用的廣泛性，新型佐劑材料的批準需要慎之又慎，這也是目前全球僅有6款佐劑材料獲得批準應用的原因. 但是我們也看到，隨著亞單位抗原越來越廣泛的運用，佐劑材料已然成為限制新疫苗技術發(fā)展的一個關鍵因素，也必將迎來飛速發(fā)展和巨大需求. 因此，新型佐劑材料的快速發(fā)展和批準在未來一定是更加值得期待的.