葡萄糖濃度波動(dòng)對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響-醫(yī)學(xué)論文

　　高糖分為持續(xù)性高糖及波動(dòng)性高糖，研究發(fā)現(xiàn)波動(dòng)性高糖同樣可以導(dǎo)致嚴(yán)重的胰島素分泌功能的損傷[1-2]，其機(jī)制并未完全研究清楚。細(xì)胞ATP是近年來研究的熱點(diǎn)，近年來發(fā)現(xiàn)胰島素的分泌和胰島β細(xì)胞內(nèi)的ATP含量關(guān)系密切[3-4]。本實(shí)驗(yàn)擬用含不同葡萄糖濃度及是否含抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）的培養(yǎng)液干預(yù)INS-1 細(xì)胞，通過比較持續(xù)性高糖及波動(dòng)性高糖對(duì)ATP生成的影響及影響機(jī)制。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　RPMI 1640-培養(yǎng)基購(gòu)自GIBAO，胎牛血清購(gòu)自上海微科生化試劑有限公司，N-乙酰半胱氨酸及ATP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于含有10%胎牛血清、0.6 mol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、1 mmol/L 丙酮酸鈉、50 mol/L 2-巰基乙醇的普通RPMI 1640-培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。

　　1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將INS-1細(xì)胞隨機(jī)分為正常糖組（5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)）、持續(xù)高糖組（16.7 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)）、波動(dòng)組（用16.7 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h，再換5.5 mmol/L培養(yǎng)3 h，每天重復(fù)3次，夜間9 h維持在5.5 mmol/L的培養(yǎng)液中）、NAC+正常糖組、NAC+持續(xù)高糖組、NAC+波動(dòng)組，后3組的培養(yǎng)基中均預(yù)先負(fù)載終濃度為1.0 mmol/L NAC，余干預(yù)措施相同，均干預(yù)72 h。每組5個(gè)培養(yǎng)皿。各組每日均同時(shí)更換培養(yǎng)基以保持相同的處理?xiàng)l件，培養(yǎng)基事先恒溫箱37 ℃水浴，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。

　　1.2.3 測(cè)定的指標(biāo)及方法 分組干預(yù)結(jié)束后，用熒光素酶法檢定細(xì)胞ATP含量，分別用2.8 mmol/L和16.7 mmol/L葡萄糖各刺激INS-1細(xì)胞1 h，收集上清后放免法測(cè)定其胰島素分泌水平，分別作為基礎(chǔ)和高糖刺激下胰島素釋放，計(jì)算高糖刺激胰島素分泌/基礎(chǔ)胰島素分泌作為胰島素分泌能力結(jié)果。結(jié)果均以胰島細(xì)胞總蛋白校正。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

　　數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，各組內(nèi)均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，若方差不齊采用Welch近似方差分析；多重比較采用LSD法（Least-significant difference test），兩兩比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 不同濃度葡萄糖及抗氧化劑對(duì)INS-1 細(xì)胞胰島素分泌水平的影響

　　六組基礎(chǔ)胰島素分泌（2.8 mmol/L 葡萄糖刺激）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），高糖刺激胰島素分泌（16.7 mmol/L葡萄糖刺激）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

　　
　　表1 六組INS-1細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌及高糖胰島素分泌(x±s，n=5）

　　
　　2.2 不同濃度葡萄糖及抗氧化劑對(duì)INS-1 細(xì)胞ATP含量及胰島素分泌能力的影響

　　由表2可知，與正常糖組相比，持續(xù)性高糖組及波動(dòng)組的胞內(nèi)ATP含量及胰島素分泌能力顯著下降（P < 0.01），且波動(dòng)組下降更明顯。使用抗氧化劑NAC干預(yù)持續(xù)性高糖組及波動(dòng)組，兩組的細(xì)胞ATP含量及胰島素分泌能力均較未使用組顯著增加（P < 0.05）。

　　3 討論

　　近年來，血糖波動(dòng)的危害越來越受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)波動(dòng)性高血糖不僅促進(jìn)糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[5-7]，也可損傷β細(xì)胞的胰島素分泌功能[1-2]。本研究發(fā)現(xiàn)，波動(dòng)性高糖及持續(xù)性高糖均可損傷INS-1細(xì)胞的胰島素分泌能力，且波動(dòng)性高糖更嚴(yán)重。

　　已有研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞胰島素分泌與ATP合成相偶聯(lián)[3-4]。葡萄糖刺激胰島素分泌的重要機(jī)制是葡萄糖增加ATP的合成，減少游離二磷酸腺苷，導(dǎo)致ATP敏感性K+通道關(guān)閉，細(xì)胞去極化，Ca2+通過鈣電壓門控通道內(nèi)流，并產(chǎn)生一系列的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)使胰島素分泌顆粒胞吐，胰島素分泌到細(xì)胞外[4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATP含量在持續(xù)性高糖組及波動(dòng)組均較正常糖組顯著下降，且波動(dòng)組下降更明顯。本研究提示，波動(dòng)性高糖及持續(xù)性高糖可能通過降低INS-1細(xì)胞的ATP生成降低其胰島素分泌能力，且波動(dòng)性高糖更嚴(yán)重。

　　高糖可引起胰島β細(xì)胞功能紊亂，胰島素分泌功能受損，其機(jī)制較復(fù)雜。近年來大量文獻(xiàn)證實(shí)氧化應(yīng)激在β細(xì)胞的損傷中發(fā)揮的重要作用[8]。胰島β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞株表達(dá)氧自由基清除酶少，對(duì)氧化應(yīng)激損傷高度敏感，本實(shí)驗(yàn)采用該細(xì)胞株進(jìn)行研究。已有多篇文獻(xiàn)證實(shí)抗氧化劑NAC能夠保護(hù)胰島β細(xì)胞的分泌功能[9]，本研究用NAC處理后發(fā)現(xiàn)，NAC+波動(dòng)組及NAC+持續(xù)高糖組的細(xì)胞ATP含量及胰島素分泌能力分別較波動(dòng)組及持續(xù)高糖組顯著增加，抗氧化劑可以顯著改善細(xì)胞ATP及胰島素分泌能力，提示波動(dòng)性高糖及持續(xù)性高糖導(dǎo)致ATP合成減少可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。

　　綜上所述，波動(dòng)性高糖及持續(xù)性高糖可能通過氧化應(yīng)激使ATP合成減少，且波動(dòng)性高糖的程度更嚴(yán)重，最終導(dǎo)致INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的損傷。這為以后改善ATP合成以減少β細(xì)胞高糖毒性提供更多的理論依據(jù)。但波動(dòng)性高糖及持續(xù)性高糖使ATP合成減少的許多具體機(jī)制仍未證實(shí)，有待進(jìn)一步的研究。