核磁共振氫譜法測定果汁中主要糖類的含量

糖含量高低是決定果汁品質(zhì)重要指標之一，也是果汁中重要的營養(yǎng)成分和風味成分[1-2]，糖類分子不但負擔著能源和結(jié)構(gòu)支架的職能，而且作為信息分子，在細胞黏著、細胞信號轉(zhuǎn)導、發(fā)育分化、免疫細胞成熟活化、生殖受精，以及共生寄生等一系列維持生命所需的重要生理過程中，起著介導和調(diào)節(jié)作用[3]。果汁中主要的糖類包括果糖、葡萄糖和蔗糖[4]。GB/T 21731—2008《橙汁及橙汁飲料》等果汁質(zhì)量標準中均對果糖、葡萄糖、蔗糖含量做了明確規(guī)定。所以準確測定果汁中的果糖、葡萄糖、蔗糖的含量對于研究果汁的品質(zhì)具有重要的意義。

通?？偺堑臏y定方法均是先利用酸水解法使沒有還原的雙糖和多糖徹底水解成有還原性的單糖，再利用還原糖的測定方法來測總糖的含量[5-7]。但總糖的測定方法無法對單糖含量準確測定，且前處理步驟繁瑣，測試耗時長。高效液相色譜法、高效毛細管電泳法雖然可對葡萄糖、果糖、蔗糖單項含量進行準確測定，但涉及的條件多，操作復(fù)雜，耗時也較長[8-10]。而且，這些常規(guī)技術(shù)一般無法實現(xiàn)對同一樣品中多種成分的同時測定，檢出限和定量限也相對較高。

目前核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)在飲料及其他食品方面的定性定量應(yīng)用越來越廣泛[11-15]，此種方法前處理簡單測試用時少，可提供復(fù)雜基質(zhì)體系中多種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并能夠同時實現(xiàn)多種物質(zhì)的定量測定。除定性定量檢測外，NMR譜還可用于非目標指紋譜圖檢測技術(shù)[16]，如用于食品類別、非法摻假、產(chǎn)地檢測等。但定性定量的目標性檢測目前還是NMR的主要應(yīng)用，2017年ACKERMANN等[17]通過使用基于PULCON原理的外標定量法，同時定量分析了糖、調(diào)味料、甜味劑、有機酸、乙醇、維生素和氨基酸等11種化合物，回收率在80%～106%，樣品制備和分析僅需25 min，相比常規(guī)方法有非常明顯的優(yōu)勢。基于此，本研究旨在開發(fā)水峰壓制的1H NMR內(nèi)標法及外標法定量檢測技術(shù)，實現(xiàn)果汁中主要糖類物質(zhì)(葡萄糖、果糖、蔗糖)快速、同步、準確定性定量測定，同時為建立果汁NMR指紋圖譜真實性鑒別技術(shù)奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬酸(99%)、蔗糖(99%)，Vetec公司；果糖(99%)、葡萄糖(99.5%)，Sigma公司；鄰苯二甲酸氫鉀(99%)，北京百靈威科技有限公司；3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉[2,2,3,3-d(4)-3-(trimethylsilyl)propionic acid sodium salt, TSP，98%]、KH2PO4(98%)，CIL公司；疊氮化鈉(NaN3，高純)，Biotopped公司；D2O(99.9%)，青島騰龍微波科技有限公司；各類水果及果汁樣品，部分由國投中魯果汁股份有限公司提供，部分購自某電商平臺(包括各類桃、蘋果、梨、橙子及其果汁)。

1.2 儀器與設(shè)備

Bruker Avance III HD 400 MHz波譜儀、Bruker pH自動調(diào)節(jié)裝置BTpH、Bruker SampleJet 5 mm高通量核磁管，Bruker Biospin，Rheinstetten公司；Bruker 579位自動進樣器，SampleJet；AB204-N天平，METTLER TOLEDO公司；KH19A離心機，北京雷勃爾離心機有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 緩沖溶液、外標、內(nèi)標溶液及標準工作液的配制

緩沖溶液配制：用天平準確稱取0.13 g NaN3和1.0 g TSP于10 mL容量瓶中，用D2O將其溶解并準確定容至10 mL，得到100 g/L TSP溶液和13 g/L NaN3溶液。準確稱取8.0 g KH2PO4，轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，加入100 mL D2O將其溶解，然后加入5 mL 磷酸以及2 mL 100 g/L TSP溶液和13 g/L NaN3溶液，最后再加入50 mL D2O。24 h后，準確測定該緩沖溶液pH值，若pH>2.0，則加入少量磷酸調(diào)整，若pH<2.0，則加入KH2PO4固體粉末，直至pH穩(wěn)定在2.0±0.02。

內(nèi)標液配制：稱取100 mg(精確至0.1 mg)鄰苯二甲酸氫鉀于10 mL容量瓶中，用重水定容，混勻。0～4 ℃密封保存。

外標液配制：稱取20.0 mg(精確至0.1 mg)檸檬酸至10 mL容量瓶，用蒸餾水定容，混勻。0～4 ℃密封保存。取800 μL檸檬酸溶液，再加入200 μL緩沖液，取600 μL于核磁管中待測。

果糖標準溶液配制：準確稱取400 mg果糖標準品于燒杯中，加入適量蒸餾水，待其完全溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并用蒸餾水定容，搖勻后得到質(zhì)量濃度為40 g/L的果糖標準溶儲備溶液。再用蒸餾水逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625 g/L的果糖標準溶液。移液槍取800 μL標準溶液，加入100 μL緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標液，移取600 μL與核磁管中測定。

葡萄糖標準溶液配制：準確稱取400.0 mg葡萄糖標準品于燒杯中，加入適量蒸餾水，待其完全溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并用蒸餾水定容，搖勻后得到質(zhì)量濃度為40 g/L的葡萄糖標準儲備溶液。再用蒸餾水逐級稀釋，依次配制成質(zhì)量濃度分別為40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625 g/L的葡萄糖標準溶液。移液槍取800 μL標準溶液，加入100 μL緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標液，移取600 μL于核磁管中測定。

蔗糖標準溶液配制：準確稱取400.0 mg蔗糖標準品于燒杯中，加入適量蒸餾水，待其完全溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并用蒸餾水定容，搖勻后得到質(zhì)量濃度為40.0 g/L的葡萄糖標準儲備液溶。再用蒸餾水逐級稀釋，依次配制成質(zhì)量濃度分別為40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625 g/L的葡萄糖標準溶液。用移液槍取800 μL標準溶液，再加入100 μL緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標液，移取600 μL于核磁管中測定。

1.3.2 水果、澄清果汁、不澄清果汁及濃縮果汁上機樣品制備

水果樣品：選取新鮮、飽滿、無病斑、無劃痕的水果(包括各類桃、蘋果、梨、橙子)，去除果皮和果核后榨汁，經(jīng)3層紗布過濾后，保留濾液。取3 mL濾液于5 mL 離心管中，8 000 r/min離心10 min，保留上清液待用，用0.45 μm水系微孔濾膜過濾至樣品瓶中，取800 μL，再加入100 μL緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標液，充分搖勻，取600 μL于核磁管中待測。

澄清果汁樣品：取800 μL果汁樣品，再加入100 μL 緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標液，充分搖勻，取600 μL于核磁管中待測。

不澄清果汁樣品：取果汁樣品于離心管中，6 000 r/min 離心10 min，取上清液，再用0.45 μm水系微孔過濾膜過濾至樣品瓶，再取800 μL，加入100 μL 緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標液，充分搖勻，取600 μL于核磁管中待測。

濃縮果汁樣品：稀釋濃縮果汁樣品使其濃度為原濃度0.5倍。取稀釋后的果汁樣品800 μL，再加入100 μL緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標液，充分搖勻，取600 μL于核磁管中待測。

1.3.3 測定參數(shù)

核磁管不旋轉(zhuǎn)；檢測溫度：(300±0.1) K；空掃次數(shù)：4次；掃描次數(shù)：16次；譜寬：20.00 ppm；采樣點數(shù)：64 k；接收增益：16；弛豫延遲：4 s；以TSP(δ = 0)作為化學位移的零點；采用布魯克標準脈沖序列noesygppr1 d用于水峰信號抑制的氫譜測試。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用MestReNova 12.0軟件(Mestrelab Research S.L.，MestReNova(Mnova)NMR，美國)對1H NMR譜圖進行傅里葉變換、基線校正、相位調(diào)整。線寬因子為0.3。相位校正選擇metabonomics算法，先自動優(yōu)化，后針對特定區(qū)域進行手動校正，使盡可能多的積分值為正值?；€校正選擇polynomial fit擬合方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品配制方法討論

如果果汁樣品不澄清，會影響測試時的勻場效果，從而影響譜圖的分辨率。所以如果果汁不澄清，需要過濾，從而保證譜圖的質(zhì)量。

pH值會影響水峰位置，如果每個樣品水峰位置相差大，那么就不能用相同的水峰壓制位置來壓制水峰，不利于批量測試，所以在樣品配制時加了緩沖溶液以穩(wěn)定pH值。

為使定量結(jié)果準確，樣品測試時需要統(tǒng)一增益值，濃縮果汁和普通果汁相比微量物質(zhì)濃度大，如果和普通果汁用同樣的增益值，信號就會溢出，譜圖會發(fā)生畸變，從而影響定量結(jié)果的準確性。所以對濃縮果汁樣品需要進行稀釋，但稀釋的倍數(shù)太大，又會影響定量的檢測限和定量限，研究發(fā)現(xiàn)對于大部分濃縮果汁，只需要稀釋一倍，同普通果汁使用相同的增益值，信號就不會發(fā)生溢出的現(xiàn)象。

2.2 果汁中水峰的壓制

由于樣品中主要是水，水的強共振信號會對樣品信號產(chǎn)生掩蓋作用，故需對溶劑信號進行壓制[18-19]，使果汁中微量成分的信號強度明顯提高。經(jīng)過溶劑峰壓制之后，果汁中糖物質(zhì)的信號顯著提高，水峰的信號對定量結(jié)果也不造成干擾。

2.3 定量方法的選擇

常用的定量方法有外標法[17,20-21]和內(nèi)標法[22-23]，二者各有其優(yōu)缺點。內(nèi)標法定量不確定度優(yōu)于外標法，內(nèi)標物和待測樣品只需經(jīng)過一次檢測即可，但需仔細選擇內(nèi)標物質(zhì)避免內(nèi)標物質(zhì)和待測物之間的相互作用，避免信號重疊，內(nèi)標物質(zhì)和待測物必須可溶于所選的NMR溶劑中。外標法無需考慮分析物和參考物質(zhì)之間的相互作用和信號重疊，但需要分別測定外標物質(zhì)和待測樣品的譜圖和脈沖寬度。所以本研究采用外標法和內(nèi)標法同時對樣品中的果糖、蔗糖、葡萄糖進行檢測。

PULCON外標法定量使用外部參考樣品，將外部參考樣品的校準轉(zhuǎn)移到實際樣品中，因此無需考慮分析物和參考樣品之間的相互作用和信號重疊。此外，采用PULCON外標法成本相對較低，可重復(fù)多次利用，進一步降低了NMR的檢測成本，簡化了前處理操作。檸檬酸結(jié)構(gòu)簡單，以水做溶劑的1H NMR譜中僅在δ 2.65和δ 2.52處有檸檬酸2個亞甲基的4個氫的2組雙峰，用于定量分析結(jié)果準確，因此選擇檸檬酸作為外部參考物，用公式(1)計算待測物的含量：

(1)

式中：C，分析物質(zhì)量濃度，mg/L；A，絕對積分面積；M，相對分子質(zhì)量；nH，質(zhì)子數(shù)；NS，掃描次數(shù)；P1，1H 90°脈沖寬度；T，檢測溫度；CF，校正因子；Quantref(Q)，外部參考樣品；Sample(S)，待測分析物。

內(nèi)標法定量需在樣品溶液中直接加入一定量的內(nèi)部參考物，在充分弛豫的條件下，核磁共振信號強度(峰面積)與產(chǎn)生該信號的原子的數(shù)目成正比，而與其化學性質(zhì)和所處的化學環(huán)境無關(guān)。鄰苯二甲酸氫鉀，化學性質(zhì)穩(wěn)定，在水中有良好的溶解性，其水溶液的1H NMR譜只有2組峰，每組峰代表2個氫原子，由圖1可知其δ 7.780 處的信號不與果汁中化合物信號峰發(fā)生重疊，所以選用鄰苯二甲酸氫鉀作為內(nèi)標物。以內(nèi)標物的相對峰面積作為參考，根據(jù)樣品指定質(zhì)子共振峰的相對峰面積計算含量，根據(jù)公式(2)計算分析物濃度：

(2)

式中：C,分析物濃度，mg/L；M,相對分子質(zhì)量；nH,質(zhì)子數(shù)；A,信號積分面積；CF,校正因子；Sample(S),待測分析物；Std,內(nèi)標物。

2.4 校正因子

公式(1)和公式(2)中都有校正因子，校正因子是在NMR波譜儀和測量條件等因素相互影響的情況下對樣品定量結(jié)果的校正，如校正水信號的壓制及弛豫不充分對定量結(jié)果準確性的影響等。標準品質(zhì)量與溶液體積之比為縱坐標，外標法或內(nèi)標法所得的濃度為橫坐標，得線性回歸y=ɑx+β，ɑ即校正因子。

2.5 定量峰和定量區(qū)域選擇

2.5.1 果糖定量峰和定量區(qū)域選擇

果糖在水中可以歸屬出3種構(gòu)型，根據(jù)果糖的1H NMR、13C NMR及二維譜1H-1H位移相關(guān)譜(correlation spectroscopy，COSY)、1H-13C 異核單量子相干(heteronuclear single-quantum coherence，HSQC)、1H-13C異核多健相關(guān)(heteronuclear multiple-bond correlation，HMBC)、J-分辨譜等，果糖主要以β-D-吡喃果糖、α-D-呋喃果糖和β-D-呋喃果糖3種主要構(gòu)型存在。在3種構(gòu)型中，β-D-吡喃果糖含量最高，其次為β-D-呋喃果糖，α-D-呋喃果糖含量最低。δ 4.100～4.092為α-D-呋喃果糖 3-H和β-D-呋喃果糖 3-H、4-H，δ 4.018～3.993歸屬為β-D-吡喃果糖6-H上一個質(zhì)子兩重峰與α-D-呋喃果糖4-H 兩個峰中一個峰。δ 3.984～3.976 歸屬為β-D-吡喃果糖5-H與α-D-呋喃果糖4-H兩個峰中另一個峰。這3個區(qū)間正好包含了果糖3種構(gòu)型中每種構(gòu)型2個質(zhì)子。而β-D-吡喃果糖6-H上一個質(zhì)子兩重峰中一個峰與蔗糖的5′-H上三重峰中一個峰重疊[1]。由圖1可知，在果汁中δ 4.100～4.092的信號與果汁中其他物質(zhì)信號沒有重疊，所以可將δ 4.100～4.092所包含的質(zhì)子數(shù)定為1，使用校正因子來校正定量的質(zhì)子數(shù)不準確的因素。

2.5.2 蔗糖定量峰和定量區(qū)域選擇

根據(jù)蔗糖的1H NMR、13C NMR及二維譜1H-1H COSY、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC、J-分辨譜等，蔗糖在水中只有一種構(gòu)型[1]，定量峰為δ:5.39(d, J = 3.8 Hz)，定量區(qū)域為δ 5.436～5.349，包含的質(zhì)子數(shù)為1；也可以選δ 4.20(d, J = 8.7 Hz)處峰作為定量峰，定量區(qū)域為δ 4.250～4.159，包含的質(zhì)子數(shù)為1。由圖1可知定量峰為δ 5.39(d, J=3.8 Hz)和δ 4.20(d, J=8.7 Hz)處的定量峰均不與果汁中其他的信號重疊。

2.5.3 葡萄糖定量峰和定量區(qū)域選擇

根據(jù)葡萄糖的1H NMR、13C NMR及二維譜1H-1H COSY、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC、J-分辨譜等，葡萄糖在水中有2種結(jié)構(gòu)[1]，ɑ-D-吡喃葡萄糖和β-D-吡喃葡萄糖。ɑ-D-吡喃葡萄糖定量峰為δ 5.23 (d，J=3.7 Hz)，定量區(qū)域為δ 5.260～5.0204，包含的質(zhì)子數(shù)為1；β-D-吡喃葡萄糖定量峰為δ 4.64(d，J=8.0 Hz)，包含的質(zhì)子數(shù)為1，定量區(qū)域為δ 4.677～4.609；δ 5.260～5.0204和δ 4.677～4.609的積分面積之和可作為葡萄糖的積分面積，由圖1可知此兩處的定量區(qū)域與果汁中其他信號不重疊。

圖1 果汁的核磁共振氫譜圖
Fig.1 1H NMR spectra of juice

2.6 方法學考察結(jié)果

2.6.1 線性考察

以標準品質(zhì)量與溶液體積之比為縱坐標，測定濃度為橫坐標做線性回歸。葡萄糖、果糖和蔗糖標準品在0.025～6.40 g/L質(zhì)量濃度內(nèi)作線性回歸圖。

檸檬酸作為定量外標，果糖回歸方程為y=1.665 6x-0.118 5，R2=1；蔗糖定量峰為δ 5.40時，回歸方程為y=1.152 1x-0.089 2，R2=1；蔗糖定量峰為δ 4.20時，回歸方程為y=1.015 4x-0.077 3，R2=1；葡萄糖回歸方程為y=1.114x+0.057 3，R2=0.999 8。結(jié)果表明該方法線性關(guān)系非常好。

鄰苯二甲酸氫鉀作為定量內(nèi)標，果糖回歸方程為y=2.027x-0.196 8，R2=0.999 5；蔗糖定量峰為5.39 ppm時，回歸方程為y=1.492 2x+0.012 6，R2=0.999 9；蔗糖定量峰為4.20 ppm時，回歸方程為y=1.309 7x-0.011，R2=0.999 9；葡萄糖回歸方程為y=1.411 9x-0.011 8，R2=0.999 7。結(jié)果表明該方法線性關(guān)系非常好。

2.6.2 精密度考察

取其中1個果汁樣品，平行配制5份，每份用外標法和內(nèi)標法分別測定6次，得到果糖、葡萄糖和蔗糖的測定結(jié)果，計算精密度。從表1～表4可見同一份樣品測實多次檢測精密度均非常高，相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)均小于1%。因為樣品配制方法簡單，所以平行配制樣品間的精密度也非常高，RSD<0.47%。

表1 果糖測定精密度(n=6)
Table 1 Precision of fructose determination method (n=6)

表2 葡萄糖測定精密度(n=6)
Table 2 Precision of glucose determination method (n=6)

表3 蔗糖測定精密度(n=6，定量峰δ 5.40)
Table 3 Precision of sucrose determination method (n=6, quantitative peak δ 5.40)

表4 蔗糖測定精密度(n=6，定量峰δ 4.20)
Table 4 Precision of sucrose determination method (n=6, quantitative peak δ 4.20)

2.6.3 加標回收率考察

配制樣品20 份，其中5 份作為對照組，其余15份由低至高，分別添加11.11、22.22、33.33 g/L 3個質(zhì)量濃度水平的果糖、葡萄糖、蔗糖，分別采用外標法和內(nèi)標法對果糖、葡萄糖、蔗糖定量，計算回收率，結(jié)果見表5和表6，外標法回收率為100.9%～104.7%，內(nèi)標法回收率為102.1%～108.6%，均能滿足測定準確性要求。

表5 外標法加標回收率
Table 5 Recovery rate of external standard method

表6 內(nèi)標法加標回收率
Table 6 Recovery rate of internal standard method

2.6.4 檢出限和定量限

將果糖、葡萄糖、蔗糖的標準品譜圖信噪比為3時的濃度作為檢出限，信噪比為10時的濃度作為定量限[15,24]。在1.3.3及1.4的測試參數(shù)及數(shù)據(jù)處理條件下，果糖的檢出限為0.005 g/L，定量限為0.018 g/L；葡萄糖的檢出限為0.007 g/L，定量限為0.022 g/L；蔗糖的檢出限為0.009 g/L，定量限為0.031 g/L。GB 5009.8—2016高效液相色譜法果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖檢出限為 0.2 g/100g，可見上述已經(jīng)建立的1H NMR定量方法檢測限要遠低于國標方法，即靈敏度要遠高于國標方法。

2.6.5 方法精確性分析

應(yīng)用上述已經(jīng)建立的1H NMR內(nèi)標和外標定量方法和GB 5009.8—2016高效液相色譜法分別對市售4種果汁樣品進行檢測，每個樣品平行前處理2次，重復(fù)測定2次，結(jié)果取平均值，如表7所示，進一步統(tǒng)計分析1H NMR法與國標法檢測結(jié)果的差異。以1H NMR內(nèi)標法、1H NMR外標法結(jié)果和國標方法比較，求RSD，除個別的結(jié)果如橙汁1中的果糖、蘋果汁3中的葡萄糖、梨汁3中的蔗糖測定結(jié)果為5%<rsd<10%外，其余rsd均小于5%，結(jié)果表明1H NMR方法與GB 5009.8—2016高效液相色譜法測定結(jié)果誤差基本在±5%以內(nèi)，滿足方法的可行性驗證要求，研究結(jié)果表明1H NMR定量法可以廣泛用于市售不同種類果汁中果糖、葡萄糖、蔗糖含量的準確測定。

表7 核磁共振波譜法與高效液相色譜法對果汁中主要糖測定結(jié)果 單位：g/L

Table 7 Determination results of main sugar content in juice by NMR and high performance liquid chromatography

3 結(jié)論

本研究建立了一種采用核磁共振技術(shù)對果汁中果糖、葡萄糖和蔗糖含量進行快速準確定量的方法。果糖的檢出限為0.005 g/L，定量限為0.018 g/L；葡萄糖的檢出限為0.007 g/L，定量限為0.022 g/L；蔗糖的檢出限為0.009 g/L，定量限為0.031 g/L。該方法在0.025～6.40 g/L線性關(guān)系良好(R2>0.999)；外標法加標回收率為100.9%～104.7%，內(nèi)標法加標回收率為102.1%～108.6%，同一份樣品測多次檢測及平行配制樣品間的精密度均非常高，RSD均小于1%，可見測定方法重復(fù)性好，GB 5009.8—2016高效液相色譜法測定結(jié)果誤差在±5%以內(nèi)，滿足方法的可行性驗證要求。該方法簡化了樣品的前處理操作，無需預(yù)先將樣品中待測物分離便可直接進行測定，極大地縮短了待測樣品的前處理時間。在確保重復(fù)性和測定結(jié)果準確性的基礎(chǔ)上，該方法極大節(jié)約了時間與人力，在大批量樣品檢測時成本較低，可廣泛應(yīng)用于果汁質(zhì)量控制，同時為建立果汁核磁共振指紋圖譜真實性鑒別技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。